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作者：吉垒，张雪豪，杨子欣，乔增莹，王浩 摘 要 设计合成了一种pH响应型的多肽聚合物，在中性条件下能够以聚合物单链的形式存在，在肿瘤微环境弱酸的刺激下发生聚集，提升入胞能力，从而实现对肿瘤细胞的高效杀伤. 首先，通过迈克尔加成的方法合成了一系列生物相容性较好的β-硫代酸酯聚合物，并利用固相合成方法合成了治疗肽和穿膜肽2种多肽. 然后，将治疗肽修饰上一种酸敏感基团，并将2种多肽通过迈克尔加成反应与聚合物共价连接. 得到的多肽聚合物能够在中性水溶液中以单链形式稳定存在，而在pH = 6.5条件下发生聚集. 最后，在细胞层面对多肽聚合物进行研究，发现其在微酸性条件下可以通过内吞作用进入到肿瘤细胞，并具有更高的抗肿瘤能力.与常规小分子化学治疗药物相比，纳米药物具有更长的循环时间[1]和被动靶向能力[2]，通常被称为增强渗透保留效应(EPR)[3, 4]. 纳米药物的独特优势实现了靶向癌症治疗，并很大程度上降低了副作用[5]， 但其仍存在不足限制了它的治疗效率[6]，实体肿瘤的渗透性是最关键的问题之一[7].肿瘤区域异常的血管构造导致了肿瘤区域血液流动不均，因此肿瘤区域内缺乏有效的扩散和流动，区域内流体较正常组织更为固定静止，这也就导致了较高的组织液压，纳米药物很难渗透进入肿瘤内部[8]，从而导致肿瘤治疗效率低下[9]. 众周知，小的粒径有助于提高穿透性[10]，但相反地，小的粒径会减少其在肿瘤区域的积累或癌细胞的摄取[11]. 因此，实现纳米药物的高渗透性并同时提升癌细胞的摄取量是非常重要的[12, 13].
近年内发展了一系列材料，能够在生理条件下特异性地在病灶部位发生所需变化[14]，并伴随有形貌结构的变化[15]. 这些材料在生物体原位发生自组装后，动力学以及物理化学性质有了明显的改善，因此吸引了越来越多的关注[16]. 我们课题组从淀粉样蛋白中提取了能够有效组装的多肽片段，该短肽在水溶液中即可发生组装并形成超分子纤维结构[17]. 当把该组装多肽与聚合物或多肽类治疗分子结合，其可以在肿瘤周围形成纤维网络结构实现化疗药物的缓释，进一步提升了治疗效率[18]. 而将组装多肽与酶响应肽以及成像分子结合，不仅能够针对肿瘤区域特异性的富集成像分子[19]，还能够显著提升成像分子在肿瘤区域内的滞留时间，对肿瘤以及肿瘤内的多种酶活性进行长效成像[20]. 另外这种组装策略还在细菌治疗以及成像中得到了广泛应用[21]. 聚合物-多肽缀合物(PPCs)具有较长的循环时间和良好的生物相容性[22]，与体内自组装策略相结合，可为实体肿瘤深度治疗提供新的方向.基于聚合物-多肽优势，我们组利用体内原位自组装策略，通过设计合成了pH敏感性PPC，能够深度递送纳米药物，提升了肿瘤治疗效果[23].但是该多肽聚合物的细胞毒性偏低，需要较高浓度才能达到比较理想的治疗效果. 如图1所示，我们在已知毒性肽中，选择一条长度相似、分子量相似但细胞毒性较强的肽[24]，用于提升对癌症细胞治疗效果. 在本文中，通过固相合成得到2种肽，一种为由pH敏感单元顺乌头酸酐(CAA)修饰的毒性肽(序列为CGGGKFxAKFxAKKFxAKFxAK)，另一种为细胞穿膜肽(序列为CYGRKKRRQRRR)；2种多肽通过硫醇-烯点击反应与主链β-硫代酸酯偶联，从而得到PS-KFx-CAA缀合物.CAA修饰的羧基可以使PS-KFx-CAA的亲水性增加，并使缀合物在水溶液中为稳定的单链状态，由于其相当小的尺寸，能渗透到实体瘤深处. 一旦到达肿瘤中的弱酸微环境中，CAA将响应性断裂并引起PS-KFx-CAA的自组装，形成尺寸约为100 nm的纳米颗粒. 聚集后的纳米颗粒可以通过内吞作用进入到肿瘤细胞，而CAA的完全水解使KFxAK的治疗活性恢复，从而有效杀死癌细胞.1 实验部分 1.1 主要原料 六氢吡啶、N-甲基吗啉(N-methylmorpholine,NMM)、 2,5-二 羟 基 苯 甲 酸 (dihydroxy-benzoicacid, DHB)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)、三异丙基硅烷(triisopropylsilane, TIS)、1,2-乙二硫醇、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF)聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA，平均相对分子质量为700)、四乙二醇丙烯酯(TEGDA)、二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)、丙烯酰氯、三乙胺、顺式乌头酸酐(cis-aconitic anhydride, CAA)、可溶于水的碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)、4-二甲基氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP)、DBD荧光分子(4-(2-aminoethylamino)-7-(N,N-dimethylsulfamoyl) benzofurazan)均 购 自 Sigma-AldrichChemical公司. CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)购自碧云天生物技术公司，溶酶体染料(LysoTracker Green DND-26)、细胞DMEM培养基(3-Dulbecco ’s Modified Eagle ’s Medium)、胎牛血清(FBS, fetal bovine serum)均购自Invitrogen公司.N-羟基丁二酰亚胺活化的Cy5荧光染料从Lumiprobe公司购买. 黑色素瘤细胞系B16F10、HELA、LO2、293T从北京协和基础医学研究所细胞培养中心购买. Wang树脂、Fmoc保护的氨基酸、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)1.2 多肽、聚合物以及PPC的合成 1.2.1 功能性多肽的制备 2种多肽(序列分别为CGGGKFxAKFxAKKFxAKFxAK, CYGRKKRRQRRR)均以Fmoc固相合成法合成. 合成顺序是从多肽的C端开始逐个合成，方法如下：首先将负载量为0.35 mmol/g的对应氨基酸的Wang树脂于DMF中溶胀2 h，结束后将树脂转移至20%的六氢吡啶DMF溶液(V/V)中15 min，来脱除树脂上Fmoc保护基；其次，将需要合成的Fmoc保护的氨基酸与HBTU称重后(均过量10倍)溶于5%的N-甲基吗啉/DMF(V/V)溶液中，与树脂混合并进行40 min偶联. 在利用茚三酮检测彻底偶联后，加入20%的六氢吡啶DMF溶液(V/V)中15 min，再次脱除树脂上Fmoc保护基.至此完成一个氨基酸的合成. 之后重复上述脱保护以及偶联的过程，直至最后一个氨基酸的脱保护完成. 最后，使用TFA/H2O/TIS/1,2-乙二硫醇(92.5/2.5/2.5/2.5, V/V/V/V)混合溶液中于冰水浴中反应3 h，将多肽从树脂上切除并脱去所有侧链保护基团. 结束后旋蒸除去三氟乙酸，产物使用乙醚进行粗提纯并于真空干燥箱中进行干燥.1.2.2 治疗性多肽的修饰 将治疗肽(19 mg (10 μmol))和CAA (11 mg(70 μmol))分别溶于DMSO，之后在搅拌下向CAA溶液中逐滴滴加多肽溶液，室温下反应过夜. 之后，对反应溶液进行透析(透析袋截留分子量MWCO为1000 Da)，除去反应溶剂及未反应的CAA. 对透析后产物进行冻干，得到淡黄色固体.1.2.3 聚合物主链的合成 本文使用迈克尔加成反应合成了一系列的聚乙二醇二丙烯酸酯与二硫苏糖醇共聚物，合成方法如下：首先，分别称取数均分子量为700 Da的聚乙二醇二丙烯酸酯0.525 g (0.75 mmol)、均分子量为300 Da的聚乙二醇二丙烯酸酯0.075 g(0.25 mmol)以及0.154 g DTT (1 mmol)，称取后分别将3种物质分别溶于1 mL除水后的DMF中.溶解后，在搅拌下向聚乙二醇二丙烯酸酯DMF溶液中滴加DTT的DMF溶液，并将混合物转移至单口瓶中，加入60 μL三乙胺(0.43 μmol). 之后反应液在搅拌下通入氮气，除去溶液中的氧气. 15 min后，将单口瓶密封并避光，在50 °C条件下反应2天.反应结束后，将反应溶液冷却到室温，并在超纯水中进行透析24 h(透析袋截留分子量MWCO为2000 Da). 透析结束后将产物冻干，得到白色黏稠状固体. 在聚合物与多肽偶联之前还需要将其进行丙烯酰化，仍以此聚合物为例合成步骤如下：称取该聚合物(n(PEGDA700):n(PEGDA300) = 3:1)0.19 g (0.5 mmol)溶于2 mL除水后的DMF中，加入1.26 mL三乙胺(9 mmol)，充分搅拌后将反应物混合液置于冰水浴中冷却至0 °C，之后在剧烈搅拌下缓慢滴加270 μL丙烯酰氯(3 mmol)，加入后室温反应过夜. 反应结束后反应产物在超纯水中透析24 h(透析袋截留分子量MWCO为2000 Da)，之后将产物冻干，得到棕黄色固体.1.2.4 pH响应型PPC的合成 实验中所用到的2种PPC均通过迈克尔加成反应合成，以PS-KFx-CAA为例，合成方法如下：首 先 称 取 丙 烯 酰 化 的 共 聚 物 (n(PEGDA700):n(PEGDA300) = 3:1) 8 mg (10 μmol/L)、修饰后的治疗肽KFxAK 20 mg (8 μmol/L)以及穿膜肽TAT 3.3 mg (2 μmol/L)于单口瓶中，并加入1 mL0.1 mol/L的NaHCO3溶液. 待反应物全部溶解后，将反应物溶液在搅拌下通入氮气除去水中的氧气.15 min后将单口瓶密封并避光，在50 °C条件下反应2天. 反应结束后，将产物在超纯水中透析24 h(透析袋截留分子量MWCO为2000 Da). 透析结束后将产物冻干，得到黄色粉末状固体.1.2.5 对PPC进行DBD/Cy5荧光修饰 以PS-KFx-CAA分子荧光修饰过程为例，对PPC进行DBD荧光修饰方法如下：首先称取6.8 mg该PPC (2 μmol/L)，并称取15 mg EDC以及8 mgDMAP溶于2 mL除水后的DMF溶液中. 将反应物置于冰水浴中冷却，之后在搅拌下缓慢加入1 mLDBD的DMF溶液(1 mg/mL)，将反应瓶避光并在室温下反应过夜. 反应结束后将产物在超纯水中透析24 h(透析袋截留分子量MWCO为2000 Da)得到DBD标记后的PPC.以PS-KFx-CAA为例对PPC进行Cy5荧光修饰方法如下：称取PS-KFx-CAA 6.8 mg (2 μmol/L)并溶于1 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液中，之后在搅拌下滴加10 μL Cy5-NHS中性缓冲溶液(1 mg/mL).将反应避光并在室温反应过夜. 反应结束后将产物在超纯水中透析24 h(透析袋截留分子量MWCO为2000 Da)，透析结束后得到亮蓝色溶液.1.3 仪器及表征方法 1.3.1 PPC临界聚集浓度的测定 临界聚集浓度(critical aggregation concentration, CAC)的测定过程中利用芘作为荧光探针，对加入芘的PPC溶液荧光值进行测定. 芘是一种极性淬灭的荧光分子，向多肽聚合物溶液中加入芘之后，如果多肽聚合物未形成聚集结构，则芘处于极性环境荧光淬灭. 而随着多肽聚合物溶液浓度增大，当开始形成聚集结构时，芘分子会因疏水作用包裹在形成的聚集结构中，从而荧光点亮.因此对加入了芘分子的不同浓度的多肽聚合物溶液进行荧光值的测定，当荧光值开始增加时，对应的浓度即为临界聚集浓度. 具体方法为：首先称取PPC并配置一系列不同浓度的PPC溶液各1 mL，加入50 μL芘的丙酮溶液(4.8 × 10−4 mol/L). 将配置好的混合液放置过夜蒸发掉其中的丙酮，最终芘的浓度控制在6 × 10−6 mol/L. 之后测定这一系列溶液的荧光光谱，参数设置是将发生波长固定在393 nm，而对溶液的激发波长在320 ~ 370 nm范围内进行扫描. 最终根据溶液在339和337 nm两处激发下的荧光强度比值对溶液溶度进行作图，计算得到该PPC的临界聚集浓度.1.3.2 粒径和zeta电位测量 所有PPC的表面电位和粒径变化均使用动态光散射(DLS)分析仪(Zetasizer Nano ZS)进行测量.仪器型号为Malvern Zetasizer Nano ZS instrument，测量在37 °C的条件下进行操作，PS-KFx-CAA缀合物(0.2 mg/mL, pH = 7.4 PB或pH = 6.5 PB)或PS-KFx缀合物(0.2 mg/mL, pH = 6.5 PB)的测量均使用塑料比色皿，加入样品量为1 mL. 在不同的时间内监测PPC在不同pH下的粒径和电位变化.1.3.3 透射电镜 用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察PPC在条件下的形貌及变化. 首先将PPC在pH = 7.4与6.5条件下配制成溶液(0.2 mg/mL)，之后取20 μL PPC溶液滴加到铜网上孵育1 min.完成后用滤纸除去多余溶液，然后滴加10 μL醋酸双氧铀溶液进行染色. 1 min后用滤纸除去染色液，并用20 μL超纯水对样品进行洗涤，每次洗涤30 s，洗涤后用滤纸除去超纯水. 洗涤3次后，样品可用于电镜观察. 所用电镜型号是Tecnai G220S-TWIN，观察时所用加速电压为200 kV.1.3.4 溶液中PPC组装行为的研究 溶液中PS-KFx-CAA聚集行为是通过测定修饰DBD荧光分子后溶液的荧光强度变化进行研究的. DBD分子的荧光受到其所处环境影响，当其所处环境由非极性转变为极性时(例如水)，则分子荧光会发生淬灭. 首先称取修饰DBD分子后的PPC，并使其以0.2 mg/mL的浓度分别溶于不同pH值(pH = 7.4, 6.5)的缓冲溶液中，其次在不同时间点对溶液的荧光光谱进行扫描. 将DBD修饰的PPC溶于DMSO中对其荧光进行测定，定义该最大发生波长下荧光值为100%，其他不同溶液不同时间点下的最大波长的荧光值除以100%的荧光值则可近似定义为其聚集程度.1.3.5 PPC的二级结构研究 用圆二色(CD)光谱(JASCO Corporation, JC-1500)研究不同pH条件下PS-KFx-CAA在不同时间节点的二级结构. 将PS-KFx-CAA以0.2 mg/mL的浓度分别溶解在不同的pH缓冲溶液(pH = 7.4,6.5)中，并将这些溶液在37 °C的条件下恒温震荡，在不同的时间节点进行CD信号监测. 用CDPro根据其测试谱图进行分析，计算二级结构中的α-螺旋百分比. 2种不同pH不同时间节点α-螺旋百分比结果通过标准算法求得(SELCON3).1.3.6 细胞毒性实验 将不同细胞以每孔5000个的密度培养至96孔板中，37 °C下培养24 h. 之后加入多肽或多肽聚合物的DMEM溶液(PS-KFx-CAA)，并且利用盐酸分别将每组溶液调整至pH = 7.4和6.5. 培养24 h后，每孔用100 μL PBS洗涤3次，之后加入10%CCK-8的DMEM溶液孵育1 h. 孵育结束后，利用酶标仪对荧光值进行检测，计算每种材料的细胞毒性. 每个实验均重复3次.1.3.7 共定位分析 通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM, confocallaser scanning microscopy)观察研究多肽聚合物入胞过程. 将细胞以2000个/孔的密度培养至共聚焦培养皿中. 之后向细胞中加入混合于DMEM培养的PS-KFx-CAA (0.17 mg/mL)溶液. 加入多肽聚合物后利用盐酸调整细胞培养基pH值至 7.4与6.5后，在37 °C下分别培养细胞2、4、8、12以及24 h后，将细胞用PBS洗涤3次，并加入LysoTrackerGreen DND-26 (300 μmol/L)染色30 min，对细胞溶酶体进行标记. 最后将样品用CLSM进行观察，仪器型号是Zeiss LSM710，所用物镜为63倍.2 结果与讨论 2.1 多肽合成及表征 图2为治疗肽KFxAK(序列为CGGGKFxAKFxAKKFxAKFxAK)与 穿 膜 肽 TAT(CYGRKKRRQRRR) 2种多肽的化学结构，2种多肽均通过Fmoc固相合成方法合成，合成完毕经乙醚提纯后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)对其分子量进行表征.
如图3所示，治疗肽KFxAK的分子式为C91H165N23O18S，其理论分子量为1900.2 Da，而所合成多肽的实测质荷比(m/z)为1901；穿膜肽TAT的分子式为C67H123N33O15S，其理论分子量为1663.0 Da，而所合成多肽实测质荷比(m/z)为1664.
将治疗肽KFxAK侧链上的氨基用CAA进行修饰(K-CAA)，其结构以及核磁图谱如图4(a)所示. 在K-CAA核磁图谱中每个峰所对应的氢原子如图中序号所示(相同化学位移的氢原子只标明了1个). 而图中δ = 6.2处的峰对应双键碳原子上氢原子的特征峰，利用该峰面积与多肽中甲基上氢原子(峰7)的峰面积之比，计算出CAA修饰率约为67%，即一条KFxAK多肽上修饰了约4个CAA分子.
2.2 多肽聚合物(PPC)的表征 实验所需的聚合物骨架结构通过1H-NMR与GPC表征，结果均可参考之前的工作[23]，这里所用主链并没有改变，可以计算得到丙烯酰氯的修饰率大约为85%.进一步地，将该丙烯酰化共聚物与2种多肽通过迈克尔加成进行偶联，将所得到的PS-KFxCAA结构则根据核磁共振氢谱结果进行确定，结果如图4(b)所示，δ = 6左右的峰几乎完全消失，证明双键几乎被彻底偶联，因此可知所合成多肽的比例与其合成时的投料比近似相等.2.3 多肽聚合物pH响应自组装行为的表征 为实现多肽聚合物在弱酸条件下的自组装，合成了一系列具有不同PEGDA比例的多肽聚合物. 对所有多肽聚合物临界聚集浓度进行测定发现，聚乙二醇二丙烯酸酯投料比为n(PEGDA700):n(PEGDA300) = 3:1的多肽聚合物PS-KFx在中性PBS溶液中的临界聚集浓度是37 μg/mL，如图5所示. 而当治疗肽修饰上CAA后，所合成的多肽聚合物PS-KFx-CAA的临界胶束浓度增大到了320 μg/mL，增大了近9倍之多. 也就是说，修饰了CAA的多肽聚合物处于37 ~ 320 μg/mL浓度范围内，就会在弱酸条件下发生聚集. 进一步地，将该质量浓度换算成其中治疗肽的摩尔浓度，则对应治疗肽摩尔浓度范围是9 ~ 77 μmol/L，而根据后续实验，该浓度范围较大程度地覆盖了KFxAK治疗肽对于多种肿瘤细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50). 因此该多肽聚合物被筛选出来用于后续实验.
在测定CAC之后，利用DLS对2种多肽聚合物的粒径进行了表征，并且对PS-KFx-CAA在弱酸条件下粒径的变化进行了初步研究. 如图6所示，在pH = 7.4条件下PS-KFx-CAA能够以单链形式存在，具有较小的粒径，在10 nm左右，并且在pH = 7.4缓冲液中能够稳定存在. 而相反地，PS-KFx-CAA在pH = 6.5缓冲液中存在一个粒径明显增大的过程. 在12 h内，PS-KFx-CAA粒径从17 nm增大到约88 nm，这就验证了之前的假设，PS-KFx-CAA由于其具有的酸敏感基团在弱酸条件下发生响应水解，从而会引起多肽聚合物临界聚集浓度的改变，进而引起其发生聚集组装. 从图中还可以明显看到，12 h后，PS-KFx-CAA粒径还远小于PS-KFx在pH = 6.5缓冲液中的粒径，这也反映出CAA并没有在pH = 6.5条件下完全水解.之后利用透射电子显微镜对PS-KFx-CAA在pH = 7.4、6.5溶液中的形貌进行观察. 如图7所示，PS-KFx-CAA在pH = 7.4缓冲液12 h后仍以较小粒径存在，而在pH = 6.5条件下12 h后粒径变大，图中观测粒径结果大约在90 nm左右，与DLS所测粒径较为符合.
然后利用DLS对3种多肽聚合物的表面电位进行了表征，如图8所示. 在pH = 7.4缓冲溶液的环境下，PS-KFx-CAA表面电位并没有发生显著变化，而其表面电位在pH = 6.5条件下会显著上升，导致表面电位上升的原因不仅仅是CAA在弱酸条件下的水解，还可能是由于其在该条件下未发生水解的基团上羟基会发生质子化. 在24 h后，PS-KFx-CAA在弱酸条件下表位电位并没有达到PS-KFx在弱酸条件下的水平，这也进一步验证了该基团在pH = 6.5条件下不能够发生完全水解.
2.4 PS-KFx-CAA的聚集组装验证 为了验证PS-KFx-CAA在弱酸条件下发生的自组装过程，我们将PS-KFx-CAA修饰上了一种极性猝灭的荧光分子DBD. 该荧光分子若处于极性环境下荧光会发生猝灭，如果修饰有该荧光分子的多肽聚合物以单链形式存在，其中的DBD基团的荧光则因暴露在水环境中而被猝灭[25, 26]. 而如果其发生聚集包裹DBD分子，则会恢复DBD的荧光信号，因此可以用荧光值强弱来判断多肽聚合物的聚集情况. 首先将修饰DBD后的2种分子PS-KFx-CAA和PS-KFx溶于DMSO (0.2 mg/mL)并测定其荧光值，由于DMSO极性较低，故定义该条件下测定的荧光值为每组的100%，如图9(a)~ 9(c)中紫色线所示. 之后将2种多肽聚合物溶于不同pH缓冲液中，测定不同时间点的荧光光谱. 利用不同时间点不同材料在水溶液中550 nm处荧光强度与在DMSO溶液中570 nm处荧光强度之比反映多肽聚合物的聚集程度，可以近似得到多肽聚合物在水中不同时间点聚集过程，如图9(d)所示.
从图9中可以看到，DBD修饰的PS-KFx-CAA在pH = 6.5缓冲液中的荧光值存在明显的上升过程，而在pH = 7.4条件下荧光值则保持了较低的水平.这2种条件导致荧光值变化的差异就说明了PSKFx-CAA在弱酸环境下会发生聚集组装的过程，而在pH = 7.4条件下则能够以单链形式稳定存在.而PS-KFx则在12 h内都表现出较高的荧光值，这表明该多肽聚合物一直以聚集体形式存在，而其荧光值整体趋势呈现小幅度下降，这可能是在弱酸条件下多肽聚合物中治疗肽侧链发生质子化导致亲水性有少量提升引起的. 而在12 h内PS-KFx-CAA虽发生聚集，但最终其荧光值与PSKFx仍存在一定差距，进一步说明了PS-KFx-CAA在pH = 6.5弱酸环境下水解并不完全.2.5 共定位分析 为了在细胞水平上验证原位组装对细胞摄取行为的影响，我们进行了细胞共定位的实验. 将材料进行Cy5红色荧光标记，并与细胞一同培育后，利用溶酶体特异性染料对细胞溶酶体进行绿色荧光标记，在共聚焦显微镜下进行观察. 如图10所示，在pH = 7.4条件下，PS-KFx-CAA在24 h后也仅仅只富集在了细胞表面. 而相反，该多肽聚合物在pH = 6.5条件下与细胞共培育在12 h后就有部分入胞，并且与图中的绿色信号重合，说明其入胞的方式是通过细胞内吞的方式. 而24 h后，则能够明显看到大量分子进入了细胞，并且与溶酶体发生了共定位. 因此，单分子链的PPC很难进入到细胞中，而在微酸性条件下，原位组装后形成的纳米粒子可以提升进入细胞的能力. 据之前的报道，具有一定尺寸(100 nm左右)的纳米颗粒入胞更加高效. 而本实验进一步验证了利用活体组装策略在治疗肿瘤时体现出的优势之一.
2.6 细胞毒性实验 多肽聚合物中具有治疗作用的治疗肽KFxAK，杀伤肿瘤细胞的机理是其形成的α-螺旋二级结构具有破膜的作用. 因此，首先在体外利用CCK-8试剂盒评价了游离KFxAK多肽的细胞毒性，并与传统毒性肽KLAK进行对比.如 图 11所 示 ， 游 离 KFxAK对 2种 细 胞 系(B16F10和HELA)的IC50值在20 ~ 60 μmol/L之间；相对于游离的KLAK，IC50值降低了一个数量级，细胞毒性明显提升，这种治疗肽细胞毒性的有效提升，对于后期实验设计存在重要意义.
细胞毒性肽KFxAK的机制基于α-螺旋结构，能够破坏线粒体膜. 如图12(a)和12(b)所示，用圆二色光谱研究不同pH溶液下在不同的时间节点PS-KFx-CAA的二级结构. 发现CAA的修饰会破坏KFxAK的α-螺旋结构. 如图12(c)所示，在pH = 7.4的条件下，PS-KFx-CAA的α-螺旋结构从19.5%略微增加至25.8%，而在pH = 6.5的条件下，12 h后PS-KFx-CAA的α-螺旋结构增加至58.9%. α-螺旋结构的恢复意味着治疗活性的激活.
随后我们对CAA修饰后的多肽聚合物进行了细胞毒性评价，如图13所示. 多肽聚合物PS-KFxCAA在pH = 7.4的条件下，对于正常的肝肾细胞(LO2、293T)几乎没有毒性，说明多肽聚合物具有较好的生物相容性. 而在pH = 6.5的条件下，PS-KFx-CAA的IC50值降低到约10 μmol/L，能够有效地杀死肿瘤细胞. 结合之前的数据，造成这一差异的原因主要是2种条件下多肽聚合物的粒径差异. 由于PS-KFx-CAA在弱酸条件下能够发生组装聚集，而聚集后的纳米颗粒其更易入胞，当该多肽聚合物进入细胞之后，其可以通过破坏线粒体膜结构从而诱导细胞发生凋亡.
3 结论 本文通过对毒性肽进行改性，解决了之前自组装聚合物-肽缀合物对于肿瘤杀伤力不强的问题，使多肽聚合物在具备原有深层药物递送效果的同时，又提升了对癌症细胞的杀伤效果. 多肽聚合物以单分子链状态深入渗透到肿瘤中，在肿瘤微环境下，可以原位自组装形成纳米粒子，并有效通过内吞作用进入到细胞中，实现高效的抗肿瘤效果. 通过进一步优化选择强效肽，可以开发高性能纳米药物，为聚合物-肽缀合物的设计提供更多的可能性. 因此，这种体内自组装策略在深层肿瘤治疗中具有巨大的潜力.免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可联系删除
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