|
题目：DROUGHT-INDUCED BRANCHED-CHAIN AMINO ACID AMINOTRANSFERASE enhances drought tolerance in rice 刊名：Plant Physiology 作者：Jun Sung Seo, Ju-Kon Kim et al. 单位：Seoul National University, Pyeongchang 日期：09 December 2022    01 摘要  植物积累多种代谢物以应对干旱胁迫，包括支链氨基酸 (BCAA)。然而，BCAA 在植物干旱反应中的作用以及 BCAA 积累的潜在分子机制仍然不清楚。在这里，我们证明水稻 ( Oryza sativa ) 干旱诱导的支链氨基酸转氨酶 (OsDIAT) 介导水稻中支链氨基酸的积累以应对干旱胁迫。体外酶活性测定表明 OsDIAT 是一种支链氨基酸氨基转移酶，亚细胞定位分析表明 OsDIAT 定位于细胞质。OsDIAT的表达在暴露于非生物胁迫的植物中被诱导。OsDIAT -过度表达（OsDIAT OX) 植物对干旱胁迫的耐受性更强，而与非转基因 (NT) 植物相比， 过表达OsDIAT植物对干旱胁迫更敏感。氨基酸分析表明，与 NT 植物相比，OsDIAT OX中的 BCAA 水平较高，但在osdiat-OE中较低。最后，与对照植物相比，BCAAs 的外源应用提高了植物对渗透胁迫的耐受性。总的来说，这些发现表明 OsDIAT 通过促进 BCAAs 的积累来介导耐旱性。 02 技术路线  将水稻（Oryza sativa“Donjin”）种子播种在Murashige和Skoog（MS）固体培养基上，并在28°C的黑暗中孵育4天。 Phylogenetic analysis 质粒构建与水稻转化 RNA isolation and reverse transcription quantitativePCR 细胞大小和细胞数量的检测 水稻原生质体的制备及瞬时基因表达 Enzyme activity assay 干旱胁迫处理与抗旱性评价 田间水稻农艺性状的评价、氨基酸喂养和PEG处理 03 主要结果 3.1 OsDIAT是一种干旱诱导基因，编码细胞质BCAT BCAA BCAT是很强的候选酶，可能在非生物胁迫条件下导致BCAA水平升高。系统发育分析将推测的水稻BCAT基因分为两个不同的亚组。OsDIAT（Os05g0244700）属于具有两个额外推定BCAT基因（Os01g0238500和Os02g0273100）的亚组，而其他五个基因与拟南芥质体BCAT形成另一个亚组。我们基于先前报道的RNA测序数据，研究了干旱条件下这些推定BCAT基因的表达模式。在这20个基因中，有8个基因在干旱条件下表现出两倍以上的表达变化。OsDIAT的表达变化在8个基因中最为显著；因此，我们专注于OsDIAT而不是其他基因。OsDIAT表达在干旱处理后1天被诱导，在干旱处理之后2-3天被进一步诱导。 为了验证OsDIAT在干旱和其他非生物胁迫条件下的表达诱导，我们使用暴露于干旱、高盐和低温条件的植物叶片和根部的总RNA进行了逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析（图1A–C）。干旱条件下，OsDIAT表达在叶片和根中均显著诱导，在叶片中诱导更强（图1A）。高盐度和低温处理的非生物胁迫条件也诱导了OsDIAT在叶片组织中的表达（图1，B和C）。因此，OsDIAT的表达主要是由非生物胁迫诱导的。干旱条件下BCAA积累需要ABA。 为了研究ABA在调节OsDIAT表达中的潜在作用，我们分析了OsDIAT的启动子区域，并在2kb启动子区域内鉴定了两个ABA响应元件（补充图2A）。为了检查OsDIAT对ABA处理的反应，我们进行了RT-qPCR分析（图1D）。作为阳性对照，我们使用了水稻脱水诱导蛋白1（OsDIP1），其表达随着ABA的反应而增加。OsDIAT表达在叶片和根中都表现出对ABA处理的剂量和时间依赖性诱导，OsDIP1也是如此（图1D）。我们通过执行时空表达谱研究了OsDIAT表达的发育调节，发现OsDIAT在根中比在其他组织中表达更高（图1E）。由于BCAT的功能取决于它们在植物中的亚细胞定位，我们检查了OsDIAT的亚细胞位置。通过电子分析预测OsDIAT是细胞质定位，我们在35S启动子（35S：：OsDIAT-GFP）的控制下生成了表达OsDIAT与绿色荧光蛋白（GFP）翻译融合的编码序列的构建体。我们在水稻中瞬时表达了这个质粒。在细胞质中检测到GFP信号，但在线粒体中没有检测到，线粒体是BCAA降解的位点（图1F）。 为了研究OsDIAT的动力学财产，在大肠杆菌中表达并纯化了该蛋白。用重组OsDIAT在正向（合成）和反向（降解）方向上进行酶测定。表1显示了所有六种支链底物的动力学值。OsDIAT在正向表现出比反向更高的效率，对BCKA的亲和力比BCAA高。总之，这些结果表明OsDIAT是一种干旱诱导的胞浆BCAT，它将α-酮酸转化为BCAA。
3.2 OsDIAT介导抗旱性 为了研究OsDIAT在干旱条件下在水稻中的生物学功能，我们产生了OsDIAT过度表达和OsDIAT突变体植物。在产生的70个独立的OsDIAT过表达转基因系中，我们选择了没有表现出发育不良的植物，以消除体细胞克隆变异的影响。基于OsDIAT在转基因植物中的表达水平，我们选择了四个独立的单拷贝纯合转基因系（OsDIATOX#1、#5、#13和#60）进行进一步分析（图2A）。为了检查植物在营养阶段在干旱条件下的表现，我们在温室中种植了选定的OsDIATOX和非转基因（NT）植物4周，并通过抑制水分使其暴露于干旱胁迫（图2，B–E）。土壤含水量（干旱处理的一个指标）在整个植物中显示出相似的下降速度，证实了胁迫处理是均匀应用的（图2B）。干旱处理期间，NT植物比OsDIATOX植物更早出现干旱诱导症状，如萎蔫、卷叶和黄化（图2C）。OsDIATOX植物在通过重新浇水缓解干旱胁迫后，与NT植物相比，恢复率也更好（图2，C和D）。OsDIATOX植物在重新浇水后7天显示出82%至93%的存活率，而NT植物仅显示出40%的存活率（图2D）。 为了进一步验证植物在干旱条件下的表现，在暴露于干旱胁迫的植物中测量了Fv/Fm值，该值是光系统II光化学效率的指标。NT植物中的Fv/Fm值在干旱处理后5天开始迅速下降，而OsDIATOX植物中的值在处理后9天显示下降（图2E）。尽管OsDIATOX转基因系中OsDIAT表达水平不同，但所有转基因系均表现出相似的耐旱表型（图2C–E），这表明#5和#60系的表达水平已经足够高，足以满足性能要求，转基因系之间的表达差异并未实质上影响性能。
我们还研究了osdiat植物的干旱反应。我们通过CRISPR（簇状规则间隔的短回文重复序列）/Cas9（CRISPR相关蛋白9）介导的基因编辑和两个独立的单引导RNA产生了四个独立的osdiat突变体（图3A）。每个突变体在OsDIAT基因座中显示出不同的突变、缺失和插入模式。RT-qPCR结果表明，osdiat突变体仍然产生转录物；然而，测序结果表明它们是异常转录物。osdiat植物比NT植物更容易受到干旱处理的时间过程的影响（图3B），而osdiat和NT植物的土壤水分含量都降低到了相似的水平（图3C）。osdiat植物在干旱处理后的存活率低于NT对照植物（图3D）。与NT植物相比，osdiat植物的Fv/Fm值开始更快地下降（在干旱处理后2天）（图3E）。这些结果表明，OsDIAT是水稻干旱反应所必需的，过表达OsDIAT可增强植物在营养阶段的抗旱性。
3.3 OsDIAT的过度表达提高了田间干旱条件下的粮食产量 产量成分，包括籽粒灌浆速率、数量和重量，是用于评估植物在生殖阶段耐旱性的基本标准。为了测试OsDIATOX转基因植物在生长繁殖阶段的抗旱性，我们评估了OsDIATOS植物在田间正常和干旱条件下的产量参数。我们在稻田中种植了四个独立的T5纯合OsDIATOX系和NT株植物，并对每个独立系30株植物的产量参数进行了两次重复（图4，a和B）。与NT植物相比，OsDIATOX植物在生殖阶段暴露于干旱胁迫条件下，其总粒重、灌浆速率和灌浆粒数显著增加（图4B）。具体而言，OsDIATOX植物的总粒重比NT植物高25%-29%。同样，OsDIATOX植物的籽粒灌浆率和灌浆粒数显著高于NT植物（分别高出21%-37%和34%-44%）。另一方面，与正常生长条件下的NT植物相比，OsDIATOX植物在产量参数方面没有表现出显著差异，尽管转基因系之间存在一些差异（图4A）。干旱条件下OsDIATOX植物产量成分的显著增加表明，OsDIAT的过度表达增强了干旱耐受性，并减轻了繁殖阶段干旱胁迫的损害。
3.4 OsDIATOX叶片中BCAA水平显著升高 当植物暴露于干旱胁迫时，BCAA会积累，但BCAA积累是否直接有助于抗旱性之前尚未进行测试。为了检查BCAA含量对耐旱性的影响，我们测量了NT植物在正常和干旱条件下的BCAA水平（图5）。在正常条件下，NT植物叶片和根组织中的BCAA水平是可比较的。然而，在干旱胁迫条件下，两种组织中的BCAA水平显著较高（图5A-F）。这些结果证实了植物在干旱胁迫下积累BCAA的发现。然后，我们分析了OsDIATOX和osdiat植物中的BCAA水平，以确定osdiat过表达或突变是否改变了植物中BCAA的积累（图5A-F）。在正常生长条件下，OsDIATOX的叶片组织中的BCAA水平显著高于NT植物，并且当两组都暴露于干旱胁迫时，OsDIATOX植物中的BCAA水平进一步增加（图5，A和E）。相比之下，OsDIATOX植物根组织中的BCAA水平与正常生长条件下的NT植物保持相似，尽管在干旱胁迫条件下OsDIATOS的BCAA高于NT根（图5B）。有趣的是，osdiat植物的叶和根组织中的BCAA水平与正常生长条件下的NT植物相似（图5，C和D），但显著低于干旱条件下的NT植物（图5、C、D和F）。这些结果表明，干旱诱导了植物中BCAA的积累，OsDIAT介导了这一过程。
3.5 外源BCAA增强渗透胁迫耐受性 为了研究BCAA对渗透胁迫耐受性的影响，我们检查了在PEG处理驱动的渗透胁迫条件下，用外源BCAA处理的植物的反应（图6）。为了提高内部BCAA水平，用丙氨酸（阴性对照）、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或脯氨酸（阳性对照）预处理根。我们使用HPLC分析了用外源BCAA预处理的植物中的BCAA水平。外源性施用BCAA导致叶组织和根组织中相应的BCAA水平增加（图6，A和B）。为了研究外源施用BCAA诱导的植物增强的耐旱性，我们将用BCAA预处理的植物转移到PEG溶液中，并监测渗透胁迫诱导的症状。在PEG处理期间，与用BCAA或脯氨酸预处理的植物相比，模拟处理的植物和用丙氨酸预处理的植株中，渗透胁迫相关症状（如叶片卷曲和萎蔫）出现得更早（图6C）。用BCAA或脯氨酸预处理的植物的相对含水量（RWC）显著高于模拟处理的植物或用丙氨酸预处理的植株（图6D）。BCAA预处理还提高了植物通过转移到正常生长培养基中而从渗透胁迫中缓解后的恢复（图6E）。最后，我们通过分析OsDIP1的表达来监测PEG处理引起的脱水应激程度。在PEG处理期间，在用BCAA预处理的植物中诱导OsDIP1表达，但用BCAA或脯氨酸预处理的植株中的OsDIP1诱导水平低于模拟处理的植株或用丙氨酸预处理的作物（图6F）。此外，恢复后，用BCAA预处理的植物中OsDIP1的表达水平低于模拟对照植物（图6F）。这些结果表明，BCAA的积累足以诱导植物的渗透胁迫耐受性。
 04 结论 在本研究中，我们研究了水稻干旱诱导的支链氨基酸氨基转移酶（OsDIAT）在BCAA生物合成和抗旱性中的分子功能，OsDIAT是属于转氨酶IV家族的水稻BCAT。OsDIAT的过度表达导致在正常和干旱条件下BCAA的积累增加。与野生型相比，OsDIAT过表达（OsDIAT OX）植物在干旱条件下表现出更高的存活率和粮食产量。相比之下，osdiat植物积累的BCAA较少，对干旱胁迫的耐受性降低。最后，外源施用BCAA增强了植物对聚乙二醇（PEG）驱动的渗透胁迫的耐受性。这些结果表明，OsDIAT调节BCAA的干旱诱导积累，进而增强植物的抗旱性。 我们提供了BCAA赋予植物耐旱性的直接遗传证据。我们还确定了一个具有高BCAA含量和增强抗旱性的工程作物的有价值的候选基因。 05 原文获取 原文链接： https://academic./plphys/article-abstract/191/2/1435/6885549?redirectedFrom=fulltext&login=false PDF获取： https://www./h-nd-170.html |
|
|
