iPSC诱导多能干细胞技术：十年进展

由iPSC领域开创者Yamanaka等人在2017年发表在Nature Reviews Drug Discovery上的综述，总结了诱导多能干细胞技术十年以来的进展

Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress | Nature Reviews Drug Discovery

摘要

自十年前诱导多能干细胞（iPSC）技术问世以来，干细胞生物学和再生医学取得了巨大进展。人类iPSCs已广泛用于疾病建模、药物发现和细胞治疗开发。新的病理机制已经阐明，来自iPSC筛选的新药正在研发中，并且首次使用人类iPSC衍生产品的临床试验已经启动。特别是，人类iPSC技术与基因编辑和3D类器官的最新发展相结合，使得基于iPSC的平台在其应用的各个领域（包括精密医学）都更加强大。在这篇综述中，我们讨论了与药物发现和再生医学特别相关的iPSC技术的应用进展，并考虑了该领域其他的挑战和新出现的机遇。

背景

2006年，科学和医学领域取得重大技术突破，有报告称通过使用四种转录因子的混合物，可以从小鼠体细胞（如成纤维细胞）中生成具有类似于胚胎干细胞（ESCs）的基因表达谱和发育潜力的细胞1。这些细胞被称为诱导多能干细胞（iPSCs），四种因子——OCT4、SOX2、KLF4和MYC——被命名为“Yamanaka 因子”。仅仅 1 年后，两个研究小组独立报道了从人类成纤维细胞中生成 iPSCs2,3。

自 2007 年以来迅速发展的人类 iPSC 技术（BOX 1）为干细胞生物学和再生医学领域以及疾病建模和药物发现领域开创了一个激动人心的新时代。该技术开发后不久，人类 iPSC 被迅速应用于生成人类“培养皿中的疾病”模型，并用于药物筛选的功效和潜在毒性。鉴于对表型筛选的兴趣激增以及人类 iPSC 在疾病建模中与传统细胞筛选相比的优势，这种方法现在变得越来越流行。这些优势包括它们源自人类、易于获取、可扩展、能够产生几乎任何所需的细胞类型、避免与人类 ESC 相关的伦理问题，以及使用患者特异性 iPSC 开发个性化药物的潜力。此外，基因编辑技术的最新进展——特别是 CRISPR–Cas9 技术——正在快速生成基于基因修饰的人类 iPSC 疾病模型。iPSC 也是新一代更具生理代表性的细胞平台的关键组成部分，该平台包含 3D 架构和多种细胞类型。

BOX 1 |人类 iPSC 技术的演进

自 2006 年开始，诱导多能干细胞 (iPSC) 技术发展迅速。由于 iPSCs 最初是通过整合病毒载体（例如逆转录病毒或慢病毒载体）引入重编程因子而产生的，因此由于转基因整合到宿主基因组中引起的插入诱变的可能性，这些 iPSCs 的临床应用受到关注细胞 204.

为了使 iPSC 在临床上更适用，已经开发了各种非整合方法来规避与逆转录病毒和慢病毒转导介导的重编程因子引入相关的插入诱变和遗传改变的风险 205。这些非整合方法包括使用游离 DNA 206,207、腺病毒208、仙台病毒209、PiggyBac 转座子210、小环211、重组蛋白212、合成修饰的mRNA213、微小RNA214,215 和小分子216进行重编程，尽管小分子方法尚不适用于诱导生成人类iPSC。

在这些方法中，游离型 DNA、合成 mRNA 和仙台病毒通常用于衍生无整合的 iPSC，因为它们相对简单和高效185。使用非病毒方法或非整合病毒可以避免基因组插入，从而降低人类 iPSC 用于临床应用时的相关风险。

iPSC技术也因其在再生医学中的潜在应用而引起了相当大的兴趣。第一项评估人类 iPSC 衍生细胞的临床研究于 2014 年启动。该研究使用人类 iPSC 衍生的视网膜色素上皮 (RPE) 细胞治疗黄斑变性4，据报道该治疗可改善患者的视力5。尽管由于在第二名患者的 iPSC 中发现了两个基因变异，该试验随后被搁置，但预计将继续进行 6。

显然，人类iPSC技术对人类疾病建模、药物发现和基于干细胞的治疗具有很大的前景，而这种潜力才刚刚开始被实现。在本文中，我们概述了自该技术发现以来的十年中 iPSC 在每个主要应用中的进展。我们提供了关键的说明性示例，讨论了其限制和解决方法，并强调了出现的新机遇。

基于 iPSC 的疾病建模

识别人类疾病的病理机制对于发现新的治疗策略具有关键作用。动物模型为人类疾病建模提供了宝贵的工具，能够识别不同发育阶段和体内环境中特定细胞类型的病理机制。此外，在小鼠中，有可能开发基于 iPSC 的体外疾病模型和对应的体内模型。将观察到的表型与相应的体外和体内小鼠模型进行比较，可以更好地了解基于体外人类 iPSC 模型的强度和局限性。

然而，实质性的物种差异可能会阻止在最常用的动物模型（例如小鼠）中重现完整的人类疾病表型。例如，尽管已经为阿尔茨海默病创建了许多转基因小鼠模型，但没有一个模型能够捕捉到人类疾病病理学的整个谱系，包括大量的神经元损失 7、8。这种疾病重演的缺乏可能是由于小鼠和人类神经细胞之间的基本物种差异。因此，迫切需要建立人类疾病建模平台来补充使用动物模型进行生物医学研究的研究。

使用原代患者来源的细胞建立疾病模型有助于研究人类疾病的病因学，并为这些疾病制定治疗策略。然而，缺乏来自患者的可扩展的原代细胞来源是一个关键的限制，特别是一些难以获得的细胞，如脑细胞和心脏细胞。因此，人类iPSCs是一个有吸引力的选择，因为原则上人类疾病(特别是那些有明确遗传原因的疾病)可以很容易地使用来自不同患者的容易获得的细胞类型(如皮肤成纤维细胞和血细胞)来建立iPSCs模型。由于其固有的自我更新特性和分化为体内几乎任何细胞类型的潜力，患者特有的iPSCs可以提供大量与疾病相关的细胞和以前无法获得的各种不同类型的细胞，如神经元和心肌细胞。此外，由于 iPSC 可以来自相关患者本身，它们可以实现个性化的疾病建模，这将成为精准医学的核心部分。

人类 ESC 和 iPSC 都已用于模拟人类遗传疾病。早期的模型是使用 ESC 开发的，但随着人类 iPSC 技术的出现，因为它们的可用性和没有使用人类 ESC 相关的潜在伦理问题，人类 iPSC 已成为首选。人类 iPSC 与人类 ESC 高度相似。这两种类型的细胞都表达人类多能因子和 ESC 表面标志物，并表现出分化成三个胚层的发育潜力2,3。体细胞的残余表观遗传记忆可能发生在 iPSCs10-12 中，这可能会影响这些细胞的分化潜能。尽管在 iPSCs10-12 中已经报道了亲代细胞的表观遗传记忆的持久性，但在大多数情况下，在使用人类 ESCs 和 iPSCs 的疾病建模中已经报道了类似的表型，这支持了使用源自患者的 iPSCs 进行疾病建模的有效性。

使用人类 iPSC 进行疾病建模的过程始于获得含有致病突变（或多个突变）的 iPSC（图 1）。然后这些细胞分化成与疾病相关的细胞类型。所得细胞用于揭示疾病病因和鉴定病理机制。在基于 iPSC 的疾病建模的早期研究中，来自未受疾病影响的个体的 iPSC 被用作患者来源的 iPSC 的对照。然而，与其他细胞类似，iPSC 表现出谱系间变异，这使数据解释变得复杂，因为必须将谱系变异与真正的疾病相关表型区分开来。

图1|基于人类IPSC的疾病建模示意图。建立和使用基于人类诱导多能干细胞(IPSC)的疾病模型通常包括以下步骤。首先，iPSCs来自患者个体，并使用CRIPSR-Cas9等基因编辑技术创建同基因型对照。然后，将iPSCs分化为特定的细胞类型，如神经细胞，并对生成的细胞进行研究，以确定疾病的特定表型。在分子水平上研究这些表型可以识别新的病理机制，为药物发现和个性化药物提供机会。

快速发展的基因组编辑技术现在能够以特定位点的方式将基因改变引入 iPSC，包括纠正患者来源iPSC中引起疾病的基因突变，以及将特定突变引入非疾病影响的野生型 iPSC。这些方法能够生成以引入突变为唯一变量的基因匹配的同基因型iPSC系，确保能可靠地识别真正的病理学原因，同时避免与可能的谱系间变异导致的遗传背景或附带现象的任何差异混淆。在对散发性或多基因疾病进行建模时，同基因型 iPSC 的控制将特别重要，因为其表型差异很小14。

可编程位点特异性核酸酶的开发，包括锌指核酸酶 (ZFN)15,16、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)17-19 和 CRISPR-Cas9 系统20-23（表 1），显著改善了基因通过在基因修饰位点诱导 DNA 双链断裂来提高人类 ESC 和 iPSC 的编辑效率。尤其是 CRISPR-Cas9 技术因其设计简单且易于使用而备受关注，并在人类 ESC 和 iPSC 的基因编辑中得到广泛应用。这种基因编辑技术使研究人员能够将致病突变引入野生型 iPSC，并消除患者 iPSC 中的此类突变，从而为基于 iPSC 的疾病建模创建同基因型对照（图 1）。

然而，在使用CRISPR-CAS9技术的应用中，一个主要的挑战是可能产生偏离目标的效果。然而，尽管CRISPR-Cas9在癌细胞系24中描述了相对较高水平的非靶标基因修改，但最近来自多个实验室使用全基因组测序(WGS)的报告表明，在正常人类细胞中，包括人的iPSCs和ESCs25-29，非靶标基因修改是罕见的。使用从原始iPSCs和相应的基因编辑iPSCs中分离的基因组DNA的WGS，结合全面的生物信息学分析25，27-29，对于检测脱靶效应(如单核苷酸变体(SNV)和插入或缺失(INDELs))是有用的，特别是对于将用于临床应用的细胞。目前，WGS价格昂贵，但预计随着技术的发展，成本将会下降。检测脱靶效应的替代方法包括外显子组测序30和靶向深度测序29。对于靶向深度测序，人们可以使用Cas-OFFinder31来搜索与人类基因组中的靶外位点不同的潜在的靶外位点，Cas-OFFinder31是一种用于识别非靶标位点的算法，包括非靶标SNV或INDELs。

基因编辑工具也在不断改进和完善，这可能有助于解决脱靶效应问题。最初的CRISPR-Cas9技术通过使用单个引导RNA指导的野生型Cas9核酸酶诱导DNA双链断裂来编辑基因组位点。由成对的引导RNA指导的Cas9的尼克酶(nickase)版本(D10A突变体)和具有增强特异性的工程Cas9核酸酶变体(ESpCas9)现在越来越多地被用于基因组编辑32-34，因为两者都显示出大大减少了脱靶效应，同时保持了严格的靶标切割34，35。此外，催化死亡的Cas9(dCas9)与转录激活因子或抑制因子融合可用于调节内源基因(所谓的CRISPRi或CRISPRa)的转录，或通过与荧光蛋白32-34、36融合来调节基因组位点的转录。对CRISPR-CAS9系统的修改还能够以精确的单等位基因或双等位基因的方式高效地显式引入DNA序列变化37。碱基编辑方面的一项最新进展利用了CRISPR-Cas9和胞苷脱氨酶的融合，使胞苷能够直接转化为尿苷，而不需要DNA双链断裂38。这一新方法提高了基因编辑效率，并将进一步促进人类ESCs和iPSCs的基因编辑。

基于iPSC的疾病模型被广泛用于研究由单基因突变引起的具有早期发病的特征的疾病(单基因疾病)39，40。这种方法非常适合于此类疾病，因为iPSCs可以很容易地从患者身上分离出来，并分化为与疾病相关的细胞，如神经元。此外，鉴于iPSCs41分化的细胞相对不成熟，更有信心的是，iPSCs分化的细胞表型为早发与晚发的疾病提供了一个很好的模型，对于这些疾病，细胞老化可能在疾病病理学中很重要。例如，从患者来源的iPSCs分化出的神经元被用来模拟脊髓性肌萎缩症(SMA)，这是一种由存活运动神经元1(SMN1)39突变引起的早发性疾病。SMN1基因的突变会导致运动神经元的退化和随后的肌肉萎缩。1型SMA患者通常在出生后6个月出现症状，病情进展迅速，到2岁时会致命42。在最初的基于IPSC的疾病模型研究39中，从1型SMA患者的成纤维细胞中获得的IPSC被分化为一种与疾病相关的细胞类型，运动神经元。从患者来源的iPSCs分化出的运动神经元与来自未受影响的对照组的运动神经元相比，存活率降低。此外，用丙戊酸和妥布霉素(两种已知可诱导SMN1表达的化合物)处理患者来源的iPSCs后，SMN1蛋白和含有SMN1蛋白的“GEM”水平增加(参考文献。39)。这项研究提供了患者来源的iPSCs可以用来模拟早发性遗传性疾病并作为潜在的药物筛选平台的原则证据。

对发病较晚的疾病进行建模更具挑战性，因为从人类iPSCs分化而来的细胞通常表现出类似胎儿的特性。然而，诱导细胞老化已被用来帮助成功地模拟迟发性疾病43-46。诱导从人iPSCs分化而来的细胞衰老的一种方法是用细胞应激源处理这些细胞：例如，使用以线粒体功能或蛋白质降解通路为靶点的MG-132和吡咯菌酯等化合物。另一种诱导细胞衰老的方法是异位表达导致过早衰老的基因产物，如progerin。然而，细胞应激源或progerin的表达是否能通过与正常衰老相似的机制诱导细胞衰老仍有待确定。此外，最近的研究表明，细胞成熟和老化可能是不同的事件41，48。目前尚不清楚细胞老化诱导剂是否可以促进细胞成熟和衰老，而不是在未成熟细胞中引发细胞衰老48。或者，直接重编程方法，包括将人成纤维细胞直接转化为其他特定血统的细胞，如神经元，不会消除细胞老化标记49。事实上，来自老化成纤维细胞的神经元通过直接重新编程维持细胞年龄50岁，因此为研究与年龄相关的疾病提供了一种替代的细胞模型。值得注意的是，在促进细胞成熟方面也取得了成功，例如通过使用改进的培养液配方51或使用神经元-星形胶质细胞共培养系统52、53。

iPSCs还提供了一种研究散发性（sporadic ）疾病(其原因尚未在患者的家族病史或基因突变中确定)的新方法，这一点很重要，因为许多疾病的大多数患者都有散发性疾病。例如，在阿尔茨海默病中，95%的患者属于散发性类别。有趣的是，对来自散发性阿尔茨海默病患者的IPSC来源的神经细胞的分析发现，几个零星病例表现出与由特定基因突变引起的家族性阿尔茨海默病相同的表型54。这一发现表明，使用ipscs对散发性疾病进行重新分类的可能性。然而，使用iPSCs模拟散发性疾病通常比模拟单基因疾病更困难，因为这类疾病的表型变化通常被认为是由多个小遗传风险变异结合环境因素引起的。尽管来自散发性疾病患者的iPSCs可能包含与疾病相关的风险变量，但因为遗传和表观遗传背景的谱系差异，使用iPSCs来模拟此类疾病是复杂的。这种变异对于模拟散发性疾病更有问题，因为散发性疾病iPSC来源的细胞的表型预计比那些来自单基因疾病的iPSC来源的表型更细微。

因此，基于人类iPSC的散发性疾病模型的一个关键问题是如何产生仅在相关风险变量14上不同的成对同基因型细胞系。使用CRISPR-Cas9技术，产生以特定疾病相关遗传风险变异为唯一变量的受基因控制的同基因型iPSC系的能力可以创建一个受控良好的系统。最近，这种方法被用来产生不同于帕金森病相关风险变量的同基因型iPSC系，与等位基因特异性分析相结合，能够有力地剖析这种遗传风险变量55。这一实验策略可用于研究与其他疾病相关的遗传风险因素。

到目前为止，已经使用源自iPSC的单一疾病相关细胞类型研究了许多疾病。例如，iPSC 衍生的神经元已被用于模拟阿尔茨海默病 54、56-68（表 2）和帕金森病 43-45、55、69-84（表3）。然而，可能需要不止一种细胞类型来有效地模拟某些疾病。事实上，类似的努力已经致力于使用患者 iPSC 衍生的神经元 85-87 和神经祖细胞 88-92 来模拟精神分裂症。为了更好地概括疾病表型，可能还需要一种以上细胞类型的共培养来研究不同细胞类型的相互作用。例如，星形胶质细胞-神经元共培养物已被用于模拟肌萎缩侧索硬化( ALS )93–96。这种共培养系统使研究疾病病理学的非细胞自主方面成为可能，否则，单细胞类型（如神经元）就不可能做到这一点。此外，这些研究有助于确定星形胶质细胞是导致肌萎缩侧索硬化症运动神经元变性的关键细胞成分，并为使用患者iPSC衍生星形胶质细胞93-96进行肌萎缩侧索硬化症的药物筛选提供了平台。

使用3D类器官可以更好地模拟不同细胞类型之间的相互作用。使用小鼠和人类的组织干细胞和多能干细胞97，已经为包括大脑、视网膜、肠道、肾脏、肝脏、肺和胃在内的多个器官生成了类器官。由于与内源性细胞组织和器官结构相似，人类iPSC衍生的类器官已被开发用于各种应用，并且特别有用，因为它们能够在模拟人类生理和发育的细胞环境中研究细胞-细胞相互作用。事实上，3D类器官已被用于模拟人体器官发育和疾病，测试治疗性化合物和细胞移植98-114（表4）。在类器官中可以按照时空顺序生成多种生理相关的细胞类型。此外，由于三维结构中不同细胞类型（如神经元和星形胶质细胞）的相互作用，在类器官中生成的细胞在功能上可能比使用定向分化培养衍生的细胞更成熟。因此，3D类器官有助于在发育相关的时空背景下解剖疾病病理学，并有可能在器官水平而不是单个细胞水平上模拟药物反应。

虽然3D类器官为基于iPSC的疾病建模提供了非常有前景的工具，但类器官技术存在局限性。一个挑战是创建一个与传统2D培养相比效率和可复现性更高的类器官平台115。最近，具有3D设计的小型旋转生物反应器的应用使前脑类器官的生成具有高重复性110。开发更标准化的类器官培养基，以及更明确的细胞外基质，将进一步促进生成高度可重复的类器官系统，该系统更适用于准确的疾病建模、药物发现和治疗开发116。另一个挑战是当前类器官系统缺乏血管97。因此，由于缺乏持续的营养供应，类器官的生长和成熟受到限制。旋转生物反应器和振荡培养平台能够提供更好的营养供应，并促进类器官的生长110，117。此外，与内皮细胞共培养能够在类器官99中生成血管样网络。此外，将体外生成的人类类器官移植到动物宿主的相关部位有助于类器官的血管化和成熟。当研究需要增大尺寸和改善成熟度的类器官时，可以应用这种移植方法。

基于iPSC的药物发现 疗效筛选

许多药物筛选基于被认为与疾病机制相关的靶点。然而，源于靶向筛选化合物的低成功率导致了对表型筛选的更大兴趣118。表型筛选的复兴得益于iPSC的发现，原因有很多，包括iPSC生产的可扩展性，这有助于分析开发。此外，iPSC的多能性意味着这些细胞可以分化为多种疾病相关的细胞类型，尤其是那些在难以获得的细胞，如神经元119。患者衍生的iPSC模型可以在培养皿中重现疾病表型和病理。从患者来源的iPSC分化出的细胞可以呈现分子和细胞表型。如果负责疾病表型的基因已知，则可通过基因编辑方法确认选择作为药物筛选读数的表型是否与疾病真正相关，并可在患者样本和/或动物模型中进一步验证120。除了表型筛选外，iPSC还可用于基于靶点的筛选。使用人类iPSC模型进行了许多药物筛选，并使用表型筛选或基于靶点的筛选确定了潜在候选药物。

为了大规模获得高纯度的靶细胞，已经建立了使用特定细胞表面标记121,122、细胞特异性启动子123和microRNAs124的纯化和富集技术。在首次报告的基于ipsc的疾病模型的大规模药物筛选中，我们从来自家族性自主神经功能异常(一种以感觉和自主神经系统神经元变性为特征的单基因早发疾病)患者的iPSCs中筛选和纯化了自主神经神经元的神经嵴前体121。该疾病是由IκB激酶复合物相关蛋白(IKBKAP)突变引起的，该突变导致剪接缺陷和产生功能失调性截断蛋白。药物筛选使用了6912种化合物，其中一种名为SKF-86466的化合物改善了疾病特异性异常剪接。有趣的是，SKF-86466对非靶细胞(包括诱导多能干细胞、成纤维细胞和淋巴细胞)无效。这些结果说明了基于ips的药物筛选在探索细胞类型特异性发病机制方面的优势。

Burkhardt等人125使用来自散发性ALS患者的诱导多能干细胞进行了疾病建模和药物筛选。作者在这些患者的运动神经元中发现了TAR DNA结合蛋白43 (TDP43)的从头聚集，因此利用TDP43聚集作为高含量药物筛选的读数，以识别降低TDP43聚集的化合物125。该研究团队还有效地利用了患者衍生的阿尔茨海默病iPSC模型126。作者在一名阿尔茨海默病患者的诱导多能干细胞衍生的皮层神经元条件培养液中发现了一种与疾病相关的蛋白——细胞外tau (eTau)，然后生成了一种针对eTau126的治疗性抗体。如果没有人类iPSC模型，这种与疾病相关的蛋白质就不会被发现。eTau导致神经元过度活跃，增加淀粉样蛋白-β的产生。使用人类iPSC模型作为识别疾病相关靶点的工具可能是未来药物开发的一个关键组成部分。Naryshkin等发现，在使用HEK293细胞系进行初步筛选后，患者来源的SMA iPSC模型可用于验证人类和疾病特异性药物反应性。这些化合物随后在患者特异性成纤维细胞和从患者来源的诱导多能干细胞分化的运动神经元中进行了验证，诱导多能干细胞作为患者特异性和疾病相关的细胞模型127。最后，在小鼠模型中评估选中化合物的体内活性127。该药物发现方法包括一个患者来源的iPSC模型作为验证步骤之一，该模型利用了患者iPSC来源的运动神经元的患者特异性和疾病相关特性。

总的来说，基于iPSCs的药物筛选已被用于评估几种疾病的1000多种化合物121,125,128129(表5)，并已确定了几种临床候选药物126,127,130(表6)。然而，这些研究需要相当长的时间(数周或更长时间)将iPSCs分化为与疾病相关的细胞类型。虽然对于表型筛选来说，这段时间似乎并不长，但较短的分化期更有利于避免细胞质量的变化。因此，正在寻求更快和更稳定的导致更高的成熟度和纯度分化方法。另一种方法是使用直接转分化产生的细胞进行药物筛选。直接转分化迫使目标体细胞(例如，成纤维细胞)表达细胞特异性转录因子，并在不经过iPSC状态49132的情况下将一种体细胞状态重编程为另一种体细胞状态。直接转分化已被用于从不同类型的体细胞(如成纤维细胞)中重新编程心肌细胞、肝细胞、神经细胞或其他类型的体细胞。如上所述，直接转分化的一个优点是可以产生反映细胞衰老重要方面的真实的人类神经元。然而，这种方法提供的不可再生的细胞来源可能不适用于大规模的药物筛选。转录因子的强制表达也提供了更快速分化患者诱导多能干细胞的潜力。在最近的一项研究中，强制表达肌源性分化1 (MYOD1)，骨骼肌分化的主要调节因子，被用于产生新的顽固性肌肉疾病病理的细胞模型，如Miyoshi myopathy133和duchenne型肌营养不良134。

在使用诱导多能干细胞的病理学研究中，需要考虑的一个重要问题是对照组的性质。对于遗传性疾病，可以通过建立患者来源的诱导多能干细胞中突变等位基因的基因校正来建立一个对照组。通过比较不同组的iPSCs(健康iPSCs、患者iPSCs和基因校正的患者iPSCs)来验证药物筛选119的结果。在散发性疾病中，诱导多能干细胞也是非常宝贵的模型。在这些案例中，由于没有已知的因果突变，很难确定对照组的性质;然而，可以考虑疾病相关的单核苷酸多态性(SNPs) 65。如下文“展望”部分所述，对于未来的药物筛选，散发性疾病诱导多能干细胞应有助于调查疾病是否由遗传因素(如SNPs、体细胞突变、嵌合或表观遗传因素)引起。这些发展可能进一步打开使用iPSCs135进行个性化药物筛选的大门。

疾病特异性诱导多能干细胞的另一个应用是药物的重新定位，即对已经批准用于特定疾病的现有药物进行测试，以发现其他疾病的新应用。例如，一个来源于纤维母细胞生长因子受体3 (FGFR3)突变的软骨发育不全患者的人类iPSC模型显示，患者来源的iPSC不能很好地分化成软骨组织136。利用该模型，筛选从缺陷软骨表型中拯救软骨分化诱导多能干细胞的分子，确定了几种他汀类药物，这些药物已被批准用于心血管疾病。该研究还发现，在fgfr3相关疾病的小鼠模型中，他汀类药物可以促进缩短肢体的生长。这些结果表明他汀类药物可能被重新定位为软骨发育不全的候选药物136。作为药物重新定位的另一个例子，抗癫痫药物ezogabine在运动神经元疾病ALS的iPSC模型中显示了疗效，目前正在进行临床试验137。在这项研究中，作者展示了ezogabine对iPSC模型的影响，该模型来自于超氧化物歧化酶1 (SOD1)基因突变的ALS患者，以及与ALS相关的其他基因(如C9ORF72和FUS)突变的ALS患者。也有研究表明，来自ALS患者的iPSC运动神经元最初表现为超兴奋状态，随后兴奋性下降138。这一发现表明，在ALS的治疗中，早期干预使用ezogabine可能是必需的。在不同的患者组中观察到相似的药物反应，使药物反应在不同ALS类型中得到推广。利用一种疾病的多种遗传形式衍生的诱导多能干细胞进行药物发现具有很大的价值，因为它允许在广泛的患者人群中测试药物的反应性。相比之下，同时分析一种药物在多个小鼠模型中的作用是具有挑战性的。

毒性筛查

新药的开发成本巨大。高成本主要是由于失败，尤其是后期临床试验中的失败，这又部分是由于未预料到的副作用139,140。新候选药物可能会出现许多无法预料的不良反应，心脏和肝脏毒性尤其值得关注。因此，人们对开发能够更有效地预测候选药物引起严重副作用的可能性的方法产生了相当大的兴趣，从而能够选择在后期试验中由于毒性而不太可能失败的候选药物。

QT 间期延长的致死性心律失常占总心脏毒性的 21%141。QT 延长是与人类 ether-a-go-go 相关基因 (hERG; 也称为 KCNH2) 通道有关的不利影响。心脏安全性测试主要依赖于 hERG 测定，因为阻断 hERG 电流被认为与称为尖端扭转型室性心动过速的致命室性心律失常有关。然而，已经发现 40-60% 的抑制 hERG 通道电流的药物不会导致 QT 延长 142,143。这些来自 hERG 检测的假阳性结果可能阻碍了有前景的药物的开发。已经提出了各种临床前策略来检测药物诱导的电生理心脏毒性，包括使用体外人离子通道测定、基于人的计算机重建和人干细胞衍生的心肌细胞144。最近的努力表明，使用人 iPSC 衍生的心肌细胞的多电极阵列可以为临床前体外测试 145 提供可靠、具有成本效益的替代物，可用于评估促心律失常风险 146。

对于肝毒性，广泛使用肝细胞系或人原代肝细胞。然而，这些模型也有局限性，包括细胞资源、冻融导致的功能丧失和批次间差异。最近，产生了人类 ESC 和 iPSC 衍生的肝细胞，它们表达功能分子，如细胞色素 P450 3A4 (CYP3A4)，可以吸收吲哚菁绿 147 并对已知的肝毒性药物作出反应 148。还报道了功能性 3D 肝器官芽，这可能会导致更好的药物筛选99。

最后，关于神经系统，目前正在开发一个使用多能干细胞评估药物不良反应的平台。为了进行这样的评估，分析细胞在神经系统中的基因表达变化，例如神经元细胞、间充质干细胞和来自培养皿中的人类 ESC 的血管内皮细胞，已被提出 149.

使用人类 iPSC 产品的临床应用

基于利用干细胞促进内源性再生过程或替代细胞移植后受损组织的再生医学的潜力已经引起了相当大的兴趣。自1998年发现人类esc以来(REF。150)和2007年的人类诱导多能干细胞(REFS 2,3)，干细胞研究界已经继续确定更适合探索人类细胞治疗和内源性修复的来源。图2总结了开发基于ipsc的细胞治疗产品的一般方法。正在进行的13项临床试验评估干细胞治疗产品，8项用于ESC-， 1项用于ipsc衍生的RPE细胞治疗黄斑变性，黄斑变性会导致眼内光敏受体的进行性恶化(见临床试验)151。2014年，第一项使用人类iPSC产品的临床研究开始于移植从患者自己的iPSC衍生的RPE薄片。治疗取得了积极的结果，停止了黄斑变性，改善了患者的视力。尽管该试验后来由于在另一位患者的iPSCs4中观察到突变而被搁置，但预计将恢复6。此外，最近的一项研究已经证明了将嵌入纤维蛋白支架的人类ESC来源的心脏祖细胞移植到严重心力衰竭患者的可行性152。

图2 |人类ips细胞治疗示意图。人类诱导多能干细胞(iPSC)为基础的细胞疗法的发展可以分为六个步骤。首先，从患病患者身上收集体细胞进行培养。第二，病人的体细胞被重新编程为诱导多能干细胞。第三，利用基因组编辑技术或病毒转导方法对患者来源的诱导多能干细胞进行基因校正。第四，矫正后的诱导多能干细胞分化成所需的细胞类型，作为基因匹配的健康供体细胞。第五，进行细胞鉴定、纯度、活性和安全性的质量控制试验。最后，将基因匹配的健康细胞移植到患者体内进行细胞治疗。

然而，在开始常规临床应用之前，需要解决与基于 iPSC 的治疗相关的几个障碍153。一个问题是 ESC 和 iPSC 的致瘤风险154。由于多能细胞在培养中维持很长时间，它们会积累核型异常和拷贝数变异并失去杂合性155。因此，在临床使用之前，iPSC 衍生产品需要仔细筛选，以确保缺乏潜在风险的基因改变 155 并严格测试以确保其纯度、质量和无菌性。对多能性诱导和维持的基础生物学知识的增加也将有助于降低与人类 iPSC 衍生和维持相关的突变发展和遗传不稳定性的风险。

尽管从 iPSC 分化的产品未显示会产生畸胎瘤，但确保最终产品不含可能产生畸胎瘤的未分化细胞至关重要。因此，需要用于将人类 iPSC 区分为具有精确身份和细胞功能的所需细胞类型的改进方案。为此，已鉴定出小分子抑制剂可诱导未分化人类多能干细胞的选择性和完全细胞死亡，而不影响其分化衍生物156,157。用这些抑制剂处理 iPSC 衍生的细胞产物可能会降低潜在的致瘤性。另一种可能的解决方案是在移植前通过对所需细胞类型的正选择和使用荧光激活细胞分选对人 ESC 标记物的负选择来对 iPSC 衍生细胞进行分类。最后，可以在移植前在动物模型中测试致瘤性风险。然而，由于动物相关试验需要很长时间，这种方法可能不适用于疾病进展迅速的患者。

在人类细胞疗法移植之前，遵守良好生产规范是强制性的。一旦细胞被安全输送，理想情况下应该监测病人潜在肿瘤的发展和免疫系统的激活情况。肿瘤监测的一种方法可能是评估经常伴随畸胎瘤形成的增强血管生成，其可以使用64Cu标记的环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸四聚体(64Cu-DOTA-RGD4)放射性示踪剂和正电子发射断层成像159进行检测。另一种方法可能是联合使用血清生物标志物(例如癌胚抗原、α-胎蛋白或人绒毛膜促性腺激素)和磁共振成像筛查，如最近所述160。然而，值得注意的是，这些方法在临床前阶段是非常有用的，特别是如果它们已经是评估终点所需的影像学程序的一部分。它们用于未来人体试验的可行性和必要性仍有待确定。

缺乏诱导免疫耐受的有效方法是人类 ESC 治疗的主要障碍。由于主要组织相容性复合物 (MHC) I 类、MHC II 类和共刺激分子的低表达水平，ESC 曾被认为具有免疫特权。尽管未分化的 ESC 可能具有免疫特权，但它们的分化衍生物可以触发细胞和体液免疫反应 162。相比之下，自体 iPSC 可能避免同种异体细胞移植所需的终生免疫抑制相关的高成本和严重副作用 163。尽管关于未分化 iPSCs 的免疫原性存在一些争议 164，但最近的研究表明 iPSCs 的分化可能导致免疫原性丧失 165-167。

应用来自个体患者自身 iPSC 或匹配供体的 iPSC 的细胞可能成为精准医疗的基石，并且具有不需要长期免疫抑制来保存移植细胞的重要优势。事实上，第一个 iPSC 临床试验使用的就是来自患者自体 iPSC 的 RPE。使用自体 iPSC 产品进行个性化细胞治疗似乎是孤儿疾病的理想选择，因为不需要大量的细胞库。然而，对于更常见的疾病，特别是脑血管意外或心肌梗塞等急性常见疾病，考虑到仔细验证每个细胞系所需的高成本和漫长的时间，自体 iPSC 治疗可能不适用于大量患者。由于这些原因，日本 iPSC RPE 试验的第二阶段将使用同种异体产品168。

同种异体 iPSC 方法还可以降低基于 iPSC 的细胞疗法的成本。排除高昂的启动成本，每条 iPSC 生产线的生产成本约为 10,000 至 20,000 美元169。满足当前良好的生产实践要求会大大增加这一成本170。生产适合临床使用的 iPSC 衍生组织产品（例如，用于脑血管意外的 iPSC 神经元细胞的分化、用于心肌梗塞的 iPSC 心肌细胞或用于黄斑退化的 iPSC RPE 细胞）的成本甚至更高，大约为 800,000 美元（参考文献 169））。为同种异体移植存储 iPSC 有可能降低成本，因为一种产品可能用于多个患者。为了促进同种异体移植，在临床前和临床环境中，需要提高常规免疫抑制方案和用于诱导免疫耐受的新型共刺激阻滞剂方案的有效性 171,172。此外，了解多能干细胞如何与免疫系统相互作用以及为什么它们可能比其他移植细胞更具耐受性，可能会导致识别新的免疫抑制机制和策略163。此外，移植到免疫特权部位可能是克服免疫排斥的一种可能策略。结合基因组编辑策略的最新进展来创建普遍接受的供体细胞可能是另一种替代方法173。

人类 iPSC 平台与最近开发的基因编辑和 3D 类器官技术的结合可以使人类 iPSC 成为基于干细胞的细胞疗法开发的更强大的细胞资源。作为一个原理上的证明，通过基因编辑校正的小鼠 iPSC 已被用于生成造血祖细胞，从而成功治疗小鼠模型中的镰状细胞性贫血 174。此外，基因校正的人类 iPSC 与 3D 类器官的整合可以使组织能够作为器官替代疗法的来源97。事实上，在原理验证研究中，人类 iPSC 衍生的肝脏类器官已被证明可以在移植小鼠中成功地产生功能性人类肝脏样组织。然而，这些方法在人类细胞治疗中的应用仍然存在挑战需要克服。例如，需要解决与基因编辑相关的潜在脱靶效应，以及类器官的局限性，如“基于 iPSC 的疾病建模”部分所述。

展望

诱导多能干细胞的发现为疾病研究提供了一个革命性的新研究平台。自iPSC第一份研究报告发表以来的10年里，将人类iPSC与其他新技术相结合，在研究疾病机制和潜在治疗方法方面取得了很大进展。但是，仍有几个重要问题有待解决。

iPSC克隆分化效率存在差异，包括来自同一个人的克隆119。在选择疾病模型研究的对照组时，这些变化是重要的考虑。应用CRISPR-Cas9技术可能有助于解决这个问题，如上所述。目前已有多篇报道表明，iPSC突变的基因校正可以改善分化细胞的疾病表型175 - 178。除了纠正疾病iPSCs中的基因突变，研究人员还成功地将基因突变引入健康iPSCs87,88。然而，CRISPR-Cas9技术与iPSC技术的结合仍然存在一些挑战，包括CRISPR-Cas9编辑的脱靶效应，对它们进行分析的高成本，以及基因编辑对具有未知致病突变或风险变异的遗传疾病的有限应用14。然而，这种组合在剖析疾病机制和开发新的细胞疗法方面的潜力是很高的。此外，CRISPR-Cas9或基于CRISPR的全基因组基因筛选在人类诱导多能干细胞中的应用179,180可以为理解人类iPSC多能性、维持和分化的基本生物学机制开辟一条新的途径。

与小鼠ESCs和诱导多能干细胞相比，小鼠ESCs和诱导多能干细胞表现为（“naive”）“初始”状态，是同质的，而人类ESCs和诱导多能干细胞表现为（“primed”）“启动”状态，在细胞数量和分化潜能上都是异质的。此外，重编程过程可以产生完全重编程的iPSCs和部分重编程的细胞，它们的分化潜能可能不同183,184。因此，在临床应用之前，人类诱导多能干细胞需要仔细选择并充分表征其多能性185。对重编程机制的进一步基础研究可能有助于研究人员开发方法，促进产生标准化的人类iPSC状态，这将导致减少技术变异，并使识别真正的生物表型。除了影响iPSC分化效率的克隆变异外，疾病建模的另一个障碍是分化细胞成熟过程中的谱系间变异。成熟细胞的获得需要改善培养条件和利用命运转换与基因调控119。最近的一项技术，microRNA switch( MicroRNA开关 )124，有望提高iPSCc分化细胞的成熟质量和减少克隆变异。

在传统的疾病模型研究中，细胞是在二维平面上培养的。然而，具有3D结构的体外模型更接近生理条件，因此可能更适合疾病病理学的研究。利用疾病特异性诱导多能干细胞，诱导几种3D结构分化的技术已经被报道186 - 191，包括那些类似于皮层、视杯、Rathke’s pouch（拉特克(氏)袋）、小脑和海马体的结构。利用复杂器官胚芽的动态模式和结构自形成，构建三维结构及其相应的网络已成为现实。这种策略已经被用于大脑异常和精神疾病的疾病模型。与外胚层组织结构的自组织类似，三维干细胞培养的内胚层组织形成已被开发并应用于胃肠道疾病建模192。来自不同谱系但具有相同遗传背景的复杂组织之间的生理相互作用，如类器官中的血脑屏障或免疫系统，可以为正常生理和疾病提供新的见解。

尽管目前的3D技术存在一些局限性(198,199)，但如“基于iPSCs的疾病建模”部分所述，将疾病特异性iPSCs与3D技术相结合，能够检测细胞的时空相互作用，从而揭示生理疾病状态，从而提供了一个前所未有的药物筛选平台，并为组织替代治疗提供了一个新的选择。然而，将人类干细胞来源的类器官移植到动物体内以产生人类组织或器官可能会在生物医学伦理学上带来值得进一步关注的新问题，例如移植的人类干细胞与宿主细胞混合并在宿主动物的神经系统和生殖系中发育的可能性。

iPSCs 还提供了一种研究散发性疾病的新方法。在 iPSC 技术发展之前，不可能在细胞模型中分析散发性疾病，但现在有几项研究已成功模拟散发性神经系统疾病 54、57、65、73、85、108、125、135、201、202。据推测，散发性疾病的病理机制可能与家族性疾病相同。然而，散发性和家族性疾病具有显着差异，例如发病年龄和严重程度以及病理学。

iPSC 模型表明，即使每个个体遗传风险的影响很小，但综合影响可能会启动和加速散发性疾病病理学的发展。此外，即使 SNP 基因分型仅表明一个很小的风险因素，它也可能是一个重要因素，使用 iPSC 技术对病理表型进行建模可能会导致对散发性疾病的重新分类。这种重新分类可能对药物开发产生重要影响。iPSC 建模有可能识别对药物有反应的患者亚组，包括那些散发性疾病的患者，这应该会提高临床试验的质量 119。还预计将结合患者 iPSC 进行医疗记录和基因组信息的大型队列分析；因此，iPSC 衍生细胞可以对与疾病相关的单个基因和蛋白质进行更精确的分析。

从疾病iPSC研究中积累信息，结合患者的个性化临床经验，将有助于疾病重新定位，其中疾病不是由临床定义，而是由细胞表型定义。如果对临床不同疾病的体外 iPSC 模型的细胞表型分析表明表型相同或相似，那么在一种情况下有效的治疗可能对其他情况有效。例如，双相情感障碍的 iPSC 模型识别出过度兴奋的神经元细胞 201。在来自 ALS203 患者的 iPSC 衍生的运动神经元中发现了类似的过度兴奋。因此，相同的治疗剂可能对这些临床上不同但细胞相似的疾病有效。从各种疾病中积累 iPSC 模型的细胞表型数据可能有助于新的分层和对不同疾病的理解，这也可能导致新的横截面治疗方法。

iPSC技术的发展产生了一种强大的新方法来定义和治疗疾病。iPSC代表了一种范式转变，因为它们现在允许我们直接观察和治疗相关的患者细胞。特别是，他们揭示了疾病表型和基因表达谱之间的新关系，这扩大并加深了我们对患者疾病发展的理解，特别是那些散发性疾病的患者。其他技术的进步，如 CRISPR–Cas9、3D 类器官和 microRNA 开关，将进一步推动基于 iPSC 的疾病建模和治疗开发的快速发展。