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小麦(Triticum aestivum)是世界上最重要的粮食作物之一，为人类提供约20%的食物热量。随着全球人口的增加，2050年小麦产量需要提高70%，培育优良品种是提高产量的有效途径。然而，使用传统方法非常耗时，培育一个新的小麦品种通常需要至少8-10年。但通过双单倍体（Doubled Haploid，DH）育种技术的运用，纯系只需1-2个世代即可产生，显著缩短育种周期，大大加快了育种进程。DH系生产包括3个环节，即单倍体诱导 、单倍体加倍和DH系繁殖与鉴定，每个环节都对纯系的生产效率至关重要。在小麦单倍体诱导环节，前期中国农业大学研究团队通过敲除玉米单倍体诱导关键基因ZmPLA1的同源基因，率先在小麦中建立了单倍体诱导(haploid induction, HI) 技术体系，单倍体诱导效率高于20%。小麦单倍体技术体系虽有了高效的诱导技术，但是该技术的应用仍需解决小麦单倍体鉴别等问题，开发高效的标记是实现小麦单倍体鉴别(haploid identification, HID) 的核心。2023年3月1日， Plant
Communications在线发表了中国农业大学陈绍江、刘晨旭团队题为“Establishment of an
efficient haploid identification system by engineering anthocyanin accumulation
in wheat embryo”，该研究利用玉米花青素调控基因ZmC1和ZmR，成功创制了小麦紫胚芽鞘诱导系PCI和紫胚诱导系PEI，实现了小麦单倍体的精准鉴别，并利用PEI诱导系成功创制了DH系，展现了该技术在小麦育种中的应用前景。前人研究表明ZmC1和ZmR可以调控植物花青素合成，中国农业大学研究团队为了测试使用ZmC1和ZmR进行小麦HID的可行性，评估了转基因品系AL-30和AL-40的色素沉着情况，这些品系分别含有pUbi驱动的ZmC1和pUbi驱动的ZmR。AL-30和AL-40在胚胎和种皮分别出现色素沉着（图1A）。除此以外，在胚胎或胚乳中没有发现AL-30、AL-40和野生型之间的差异。接下来，通过将AL-30和AL-40杂交，研究团队创造了一个同时具有ZmC1和ZmR的F1。结果表明，成熟的胚胎（ME），未成熟的胚胎（IE）和F1果核的外胚层都显示出深紫色色素，表明ZmC1和ZmR能协同促进花青素的积累(图1A）。然而，ZmC1和ZmR的同时过表达也导致导致叶片强烈的色素沉着，严重阻碍了幼苗的生长，最终导致死亡。因此，不能简单地将pUbi驱动的ZmC1和ZmR用于小麦的HID。研究团队将组成型表达ZmC1的材料AL-30与诱导系进行杂交，通过分子标记与表型辅助选择，育成了紫胚芽鞘诱导系PCI。利用该诱导系杂交的后代，根据胚芽鞘颜色可实现单倍体精准鉴别（图1B-C），单倍体鉴别准确率为96.3%（图1G-H）。图1 中国农业大学研究团队建立的高效小麦HID系统为了在种子阶段实现可视化的HID，研究团队确定了一个胚胎偏好的启动子Oleosin-like基因—TaOle。TaOle的1419bp启动子片段与ZmR和ZmC1的CDS融合，构成pTaOle驱动的ZmR-P2A-ZmC1表达载体（图1D）。将该载体被转化到小麦单倍体诱导系TaPLA-4A和TaPLA-4D中，结果表明所有四个阳性转基因植株在IE和ME中都显示出深紫色的色素沉着，但在其他组织中没有染色，表明pTaOle在转基因植物的胚胎中工作良好（图1E）。更重要的是，这些转基因植物的生长和发育没有受到影响，这是对AL-30和AL-40的F1杂种的巨大改良。在T1代中，具有ZmR-P2A-Zm纯合基因型的个体被筛选并命名为紫色胚胎诱导系（PEI）。为了测试HID的性能，研究团队用CS、JW1和MR-H的胚胎供体植物与花粉来自同源的T1 PEI植物的花粉杂交。根据IE和ME中色素沉着的缺失情况，筛选出推测的单倍体（图1F），并通过流式细胞仪和表型进一步验证（图1G）。在IE阶段，有11个和9个推定的单倍体分别来自CS和JW1，后被验证为真正的单倍体；在ME阶段，有2个、6个和3个假定的单倍体分别来自CS、JW1和MR-H。倍性分析的结果显示分析结果显示，只有MR-H的一个推定单倍体被发现是二倍体（6N）。为了进一步评估HID的准确性，在T2代中筛选了13个假定的CS单倍体，所有这些都被证实是真正的单倍体。因此，在IE和ME阶段的总体HID准确性为97.7%（图1H）。同样的方法用于验证18个假定的二倍体(6N）的紫色胚胎，所有这些胚胎都被确认为真正的二倍体（6N）。上述结果表明，PEI可以实现小麦的高效HID。此外，研究团队将F1杂交种（CS×Fielder）与PEI杂交，产生单倍体用于染色体加倍。总共获得11个单倍体，所有的单倍体在秋水仙素处理后都加倍了。为了研究DH是否在所有的染色体上都是纯合的，用靶向测序技术对11个DH的基因组进行了基因分型。9158个单核苷酸多态性（SNPs）的生物信息学分析显示，没有一个DH携带杂合的位点（图1I），表明PEI可以诱导纯合子，并可能成为小麦DH育种的一个前景广阔的工具。该研究原创的小麦单倍体花青素标记鉴别系统，为新型小麦单倍体育种技术从理论研究到实践应用迈出了一大步，提速小麦单倍体技术产业化的进程，对于加快小麦育种进程具有里程碑式的意义。综上所述， DH育种因具备周期短、纯度高等优点，获得了国内外各大农业公司及育种单位的密切关注。对于种业公司来说，早日推出优异新品种就可以早日获取效益，而对于育种家们来说，缩短育种周期、加快育种速度是他们毕生的奋斗目标。随着单倍体诱导关键调控基因的进一步挖掘和基因编辑技术的联合使用， DH育种技术已经不仅仅局限在玉米纯系的创制上，其应用也由玉米拓展到单子叶作物水稻、小麦、谷子，以及双子叶拟南芥、蒺藜苜蓿、番茄、烟草等多种植物上，未来 DH育种技术在作物育种和改良上将发挥更大的作用，粮食作物以及蔬菜经济作物工厂化应用将很快到来。 —— 参考文献 —— Qi X, Guo S, Zhong Y, et al. Establishment of an efficient haploid identification system by engineering anthocyanin accumulation in wheat embryo. Plant Communications, 2023, 100568.
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