【原】利用响应红光的光遗传学工具成功控制线虫行为

2023.03.09

利用响应红光的光遗传学工具成功控制线虫行为

自然科学研究机构基础生物学研究所 自然科学研究机构生命创建探索中心 名古屋市立大学 

　使用响应光的蛋白质控制细胞和个体的被称为光遗传学的方法，近年来在生物学的各种领域被广泛使用。 与人类有很多共同点，在研究正在进行的线虫中，光遗传学的应用也在进行。 这次，基础生物学研究所/生命创成探究中心的前助教小田茂和、海老根映美研究员、中村彰伸研究员(现:产业技术综合研究所)、青木一洋教授等人通过与名古屋市立大学木村幸太郎教授小组的共同研究，利用对红色光响应的光遗传学，成功地用光控制了线虫的行为。在以往的线虫研究中，使用了对紫外光和蓝光等短波长光进行响应的光遗传学工具。 但是，线虫有讨厌蓝光的习性，所以使用这些工具需要使用对蓝光没有反应的突变体的线虫。 由于使用突变体进行的研究可能会对生理功能产生不少影响，因此，不使用蓝光的光遗传学工具备受期待。 本研究涉及由响应红光/近红外光的细胞色素B(Phytochrome B，PhyB )及其结合因子PIF组成的PhyB-PIF系统，以及在细胞内合成PhyB光响应所需的丝裂霉素( PCB )的系统。 此外，通过控制肠道细胞内的钙浓度，用光成功地控制了线虫的排便节奏。 将本研究所用的PhyB-PIF和SynPCB应用于线虫，有望在未来更直接地理解线虫细胞内信号转导与行为的相关性。 本成果于2023年2月21日刊登在国际学术杂志《ACS Synthetic Biology》上。图:红光调控肠道细胞钙浓度，光调控线虫排便节律( DMP )成功
【研究背景】 线虫由于容易饲养和生命周期短等原因，被用于广泛的研究领域。 因为是多细胞，所以是适合个体水平上的行动和表现型研究的模型实验动物之一。 在迄今为止的线虫研究中，主要采取的是基因破坏和药剂处理等给与干扰(扰动)并观察其响应的方法。 但是，这些方法在技术上很难任意控制扰动的时机及其空间位置。 作为替代方法，近年来可以用光控制蛋白质、细胞、个体的光遗传学的应用备受期待。 通过使用光，可以无创地在任意时刻操作基因表达和蛋白质的活性。 线虫也可以利用对蓝色光产生应答的通道视紫红质来操作神经细胞，以及利用对蓝色光产生应答的蛋白质来操作细胞内的信号传递。 然而，线虫具有紫-蓝光受体LITE-1，已知其通过LITE-1对蓝光和紫外线等短波长光表现出回避行为(负趋光性)。 因此，使用蓝光光遗传学工具时，一直使用缺失LITE-1的突变体线虫。 但是，在使用突变体的研究中，需要慎重地研究对生理功能的影响，期待应用使用更长波长光的光遗传学工具。 本研究将利用响应红光/近红外光的细胞色素B(Phytochrome B，PhyB )及其结合因子PIF的光遗传学系统导入线虫，以操作线虫的细胞内信号和行为为目标。 
【研究成果】 PhyB是高等植物中存在的红光/近红外受体蛋白。 众所周知，为了使PhyB对光产生响应，需要一种叫做植物血红蛋白和藻蓝蛋白( PCB )的发色团(图1A )。 但是，这些发色团由植物和蓝藻合成，而其他动物则不合成。 因此，动物细胞利用使用PhyB及其结合因子PIF的光遗传学系统，需要从蓝藻中提取、纯化PCB，并将其添加到细胞中。 因此，研究小组首先向线虫中添加了精制的PCB，确认了PCB渗透到哪个组织(图1B )。 在作为线虫食物的大肠杆菌中添加PCB溶液，观察PCB在肠、神经、体壁肌中的渗透，可以确认PCB渗透到了肠中，但在神经和体壁肌等更深的组织中没有发现。 这些结果表明，线虫的神经和体壁肌等组织无法利用使用精制PCB的PhyB-PIF。 因此，研究小组决定将以前本小组开发的SynPCB系统应用于线虫。 SynPCB系统是在不能进行PCB合成的生物中合成PCB的基因系统(图1C )。 蓝藻利用4个基因产物，从血红素代谢成胆绿素，再代谢成PCB，用于光合作用。 因此，在SynPCB系统中，从基因工程上分离了蓝藻携带的PCB合成相关的4个基因( PcyA、HO1、Fd、Fnr )，进而在血红素丰富的线粒体内表达这些基因产物， 将改良了该SynPCB系统的名为SynPCB2.0的基因导入线虫中，研究了PhyB-PIF系统所需的PCB是否由线虫的组织合成。 结果，正如期待的那样，不仅在肠，在神经和体壁肌中也确认了PCB的合成(图1D )。 图1 :响应红光/近红外光的光遗传学开关PhyB-PIF和藻蓝蛋白合成系SynPCB系统在线虫中的应用 ( a )具有丝裂霉素( PCB )作为发色团的细胞色素B(PhyB )在红光( 625 nm )下与结合因子PIF结合，在近红外光( 730 nm )下解离。 ( b )左图为将从蓝藻中纯化的PCB溶液添加到线虫中，调查PCB是否渗透到线虫组织内的实验。 右图显示了与PhyB突变体结合的来自PCB的荧光。 虽然在肠中观察到来自PCB的荧光，但是在神经、体壁肌中没有观察到来自PCB的荧光。 ( c )岩藻蓝蛋白的合成体系。 PCB合成需要4个酶( HO1，PcyA，Fd，Fnr )。 ( d )左图显示了PCB合成所需的基因表达系统SynPCB2.0和PhyB、PIF系统向线虫的导入。 右图显示，使用SynPCB2.0系统，线虫的肠、神经、体壁肌中PCB可以合成。 

其次，研究小组为了调查线虫内合成的PCB对PhyB红光的响应是否充分，观察了PhyB和PIF的红光/近红外光依赖性的结合和偏离。 为此，构建了使PhyB和PIF结合后，PIF在细胞内的定位会发生变化的实验系统。 通过向PhyB赋予脂质修饰信号，使其定位于浆细胞正下方，使融合了绿色荧光蛋白质mNeonGreen的PIF表达于细胞质中，设计为照射红光时可以观察到PIF-mNeonGreen向浆细胞移动(图2上) 结果观察到，照射红光后，PIF-mNeonGreen如预期迁移至浆细胞膜，照射近红外光后返回细胞质(图2下)。 这些结果表明，通过SynPCB系统，可以在线虫体内利用PhyB-PIF的光遗传学开关。 

 图2 :使用2: PhyB-PIF系统的红光/近红外光相关局域变化 定位于细胞质的PIF-mNeonGreen在红光照射下与定位于细胞膜的PhyB结合，向细胞膜移动。 PhyB和PIF的复合体在近红外光的作用下解离，PIF-mNeonGreen返回细胞质(图上)。 线虫肠道细胞内表达的PIF-mNeonGreen呈红色/近红外光依赖性穿梭于细胞质和细胞膜(见图)。 视频: https://www.nibb.AC.jp/press room/news/uploads/2023 03 09/movie1. gif

 
其次，研究小组尝试了通过红光/近红外光操纵线虫个体内的细胞内信号传导。 将在培养细胞中已经有报道的钙离子( Ca2+ )的细胞质释放体系导入线虫中。 在这个系统中，定位于细胞质的PIF-Gaq与定位于浆细胞的PhyB结合转移到浆细胞后，磷脂酶c beta ( plcb )被激活，囊泡释放Ca2+。 (图3A )。 将钙报告子GCaMP6s与SynPCB系统及PhyB-PIF光遗传学开关同时导入线虫肠道，用红光照射后，成功通过红光照射使Ca2+浓度急剧上升(图3B )。 

 图3: PhyB-PIF及SynPCB系统对线虫肠道细胞内Ca2+浓度的光操作 ( a )使用PhyB-PIF系统的细胞内Ca2+浓度的光操作示意图。 红光照射下PIF-Gaq与PhyB结合迁移至细胞膜，激活PLCb。 PLCb生成的肌醇1，4，5 -三磷酸( InsP3 )与囊泡上的受体结合，诱导囊泡释放Ca2+。 ( b )用珠子固定导入了A的PhyB-PIF和SynPCB系统的线虫，显示了照射红光/近红外光时Ca2+浓度的变化。 视频: https://www.nibb.AC.jp/press room/news/uploads/2023 03 09/movie2. gif
 

　最后，我们尝试了能否操纵线虫在光线作用下的行为。 线虫排便运动程序( defecation motor program，DMP )是摄食时约每50秒发生一次的周期性排便行为。 已知DMP时，肠细胞的Ca2+浓度上升(图4A )。 在DMP中，Ca2+浓度上升后，体后部的体壁肌发生收缩，可见肠内腔的锯齿图案( posterior body muscle contraction，pBoc )。 接下来，会发生体前部的肌肉收缩( anterior body muscle contraction，aBoc )，肠内容物的排出( expulsion，exp )。 虽然用遗传学的方法鉴定了几个与DMP相关的基因，但是仅通过Ca2+浓度的上升就能诱导DMP这样的Ca2+和DMP的因果关系还不充分。 因此，研究小组利用图3的线虫，对自由行动的线虫照射红光/近红外光，使肠内细胞的Ca2+浓度上升时，是否会引起DMP进行了调查。 结果，照射红色光后，身体后部发生收缩，观察到肠道内腔的锯齿图案，确认引起了pBoc (图4B )。 这些结果表明，肠道细胞中Ca2+浓度升高会导致DMP的第一步pBoc。 图4 :红光Ca2+升高诱导线虫排便运动程序( DMP ) ( a )线虫排便运动方案。 发生体后部肠周边肌肉收缩，将粪便收集到体前部( posterior body muscle contraction，pBoc )，然后通过体前部肌肉收缩将粪便输送到体后部( anterior body muscle contraction，anterior ) 最后，排出粪便( expulsion，exp )。 ( b )红光照射导入了图3A的PhyB-PIF和SynPCB系统的线虫时肠的情况。 照射红光后，肠的内腔显示为锯齿形态，由此可知发生了pBoc。 视频: https://www.nibb.AC.jp/press room/news/uploads/2023 03 09/movie3. gif
 

【今后的展望】 本研究成功地将红光/近红外光的光遗传学工具PhyB-PIF系统和SynPCB系统应用于线虫。 此外，还表明了可以利用红光/近红外光控制线虫的行动。 但是，也确认了在线虫中高表达SynPCB会产生毒性，在应用上需要注意。 另外，不仅需要导入SynPCB，还需要导入PhyB和PIF，还需要优化导入线虫的多个基因的表达量。 预计这些可以通过用基因组编辑等方法将外源基因整合到线虫基因组的适当位置来改善。 将来有望利用PhyB-PIF系统和SynPCB系统，理解线虫和更大型动物的细胞内信号传递和行为的关联性。 
【发表杂志】 杂志名称ACS Synthetic Biology 刊登日期2023年2月21日 论文标题: optical control of cell signaling with red/far-red light-responsive opto genetic tools in Caenorhabditis elegans。 (线虫中红光/远红外光对信号转导系统的光操作) 作者: Shigekazu Oda*，Emi Sato-Ebine*，Akinobu Nakamura，Koutarou D. Kimura，and Kazuhiro Aoki ( *co-first authors )doi:https://pubs.ACS.org/doi/10.1021/acssynbio.2c 00461

【研究小组】 本研究是由基础生物学研究所/生命创建探究中心的青木一洋教授、名古屋市立大学的木村幸太郎教授组成的共同研究小组的成果。

【研究支持】 本研究是在以下补助金的支持下实施的。 日本学术振兴会科研经费基础研究( b ) ( 22H02625 :青木一洋) 日本学术振兴会科研经费基础研究( b ) ( 21H02533 :木村幸太郎) 日本学术振兴会科研费学术变革领域研究( a )“融合网络物理空间的分层生物导航”( 21H05299 :木村幸太郎) 日本学术振兴会科研经费新学术领域研究“通过共振诱导创新的生物成像”( 18H04754 :青木一洋) 日本学术振兴会科研费新学术领域研究“以信息物理学为依据的生命秩序和设计原理”( 19H05798 :青木一洋) 科学技术振兴机构CREST(JPMJCR1654 :青木一洋) ExCELLS课题研究(系列发掘) ( 22EXC206 :木村幸太郎、青木一洋)

【关于本研究的咨询方式】 基础生物学研究所定量生物学研究部门 生命创建探究中心定量生物学研究组 教授青木一洋 TEL:[phone] E-mail:k-aoki@ 【新闻负责人】 基础生物学研究所宣传室 TEL:[phone] 传真: [phone] E-mail:press@ 自然科学研究机构生命创建探索中心研究战略室 TEL:[phone] 传真: [phone] e-mail:press @ excells.Orion.AC.jp 名古屋市立大学总务部宣传室宣传系 TEL:[phone] 传真: [phone] e-mail:ncu _ public @ sec.Nagoya-Cu.AC.jp