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文献精读 Cement Concr. Compos.：通过微量量热法和原位氧浓度测量法测定自修复混凝土水凝胶中球形芽孢杆菌的活力  背景介绍 基于微生物修复剂的自修复混凝土，其原理是使用能诱导碳酸钙沉淀的细菌菌株作为修复剂，当裂缝出现时，裂缝内的微生物孢子将与营养物质、水、氧气接触，生成碳酸钙填堵裂缝，从而达到裂缝修复的效果。球形芽孢杆菌不仅能分解尿素产生碳酸钙沉淀，还可通过硝酸盐还原途径生成碳酸钙。因此，本研究将采用球形芽孢杆菌，从尿素水解与硝酸盐还原的两种代谢途径，提高碳酸钙的产率，进一步研究自修复混凝土。 研究出发点 以往研究大多以间接测量的方法，考察掺入混凝土后的微生物活性和裂缝修复效果。其中，尿素水解和碳酸钙沉淀的间接测量是混凝土内部微生物酶活性维持的证据，并不能真正证明微生物的活力和生长。因此，本研究通过微量量热法对水凝胶封装后微生物的存活进行了直接和可靠的测量。在砂浆中进一步掺入后，使用光学氧传感器系统测量氧气分布，进一步证明裂缝附近的微生物活性。 全文速览 比利时-根特大学-Nele De Belie课题组，通过微量量热法对水凝胶封装后微生物的存活进行了直接和可靠的测量。在砂浆中进一步掺入后，使用光学氧气传感系统确定了耗氧量。显微镜分析表明，培养24h后球形芽孢杆菌产孢率高达90%。微量热仪测量到了培养第三天微生物活动产生的热量。这证明细了菌可在水凝胶保护后被激活。在开裂的砂浆上应用氧气传感膜，裂缝开口附近的氧浓度降低至66%。这证实了球形芽孢杆菌被激活，并在掺入砂浆试样后将氧气作为电子受体用于其新陈代谢。相关论文以“Viability determination of Bacillus sphaericus after encapsulation in hydrogel for self-healing concrete via microcalorimetry and in situ oxygen concentration measurements”为题，于2021年发表在《Cement and Concrete Composites》上。 图文解析 （1）球形芽孢杆菌的内生孢子生产 球形芽孢杆菌在大多数液体培养基中的产孢量有限，对此，本研究尝试在一种新的酵母琼脂培养基（由2 g/L的酵母提取物和15 g/L的琼脂组成）中产孢，以研究是否会增加生长和孢子产量。结果表明，培养24h后营养细胞生长迅速，产孢量大。具体如图1所示，从前8h开始，显微镜下观察到细菌营养细胞数量不断增加（黑色棒状，大小约为5-8 μm），12h后，营养细胞继续生长，直到细胞达到密度/丰度。不久之后，营养细胞开始产生孢子。内孢子为1 ~ 2 μm大小的圆形小孢子。24h时，几乎90%的营养细胞都由孢子形成内生孢子。  图1 100倍镜下球形芽孢杆菌的生长和产孢 （2）水凝胶的溶胀能力 在pH为6 ~ 12的水溶液中，测试了壳聚糖改性水凝胶的吸湿能力和pH响应性。同时，还加入了水泥滤液，研究水凝胶在砂浆搅拌过程中的溶胀行为。由图2可知，当pH为8时，无论是否含细菌，水凝胶的溶胀能力最高；当pH为12时，在水泥滤液溶液中，两种水凝胶的溶胀能力都有最显著的下降，说明溶胀能力对高pH更为敏感，而水泥滤液中的阳离子对溶胀能力的影响非常有限。此外，有细菌作用的水凝胶的溶胀能力相对低于无细菌作用的水凝胶，但在不同pH的溶液中，两种水凝胶的溶胀能力平均相差4.8%左右，说明细菌对水凝胶性能的影响可以忽略不计。  图2 不同pH条件下含菌和不含菌水凝胶的溶胀能力 （3）水凝胶内细菌萌发和生长的微量量热分析 如图3a，每个样品的放热主峰按孢子浓度从高到低的顺序出现，内生孢子浓度最高的溶液（109 cells/mL）首先产生热量，在24h达到约230 μW 的最高热流。然后在36h出现第二高浓度108 cells/mL的样品，直到最后一个浓度104 cells/mL在84h左右出现峰值。在孵育过程中，所有孢子悬浮液都达到了相同的最大热流量，约为220-230 μW，这表明尽管细菌开始生长的初始内生孢子浓度不同，但它们最终都达到了相同的细胞密度；均匀性可能是由每个小瓶中的营养物质和氧气的限制引起的。此外，在早期的每条曲线中都观察到一个最大值约为10 μW 的小峰，这可能是由于孢子萌发。 如图3b，接种在纯酵母培养基中的内生孢子（109 cells/mL）产生热量非常快，最大热流在12h达到约 300 μW。而在酵母和尿素培养基中，内生孢子的萌发和生长速度较慢，在40 h时产生的最大热流约为200 μW。在纯尿素培养基中没有检测到曲线，尿素不能作为支持细菌生长的有机电子供体。 如图3c，每种培养基的另外三个平行结果再次证实接种在酵母和尿素培养基中的孢子比纯酵母培养基中的孢子发芽和生长更慢。这表明在酵母和尿素培养基中，尿素水解过程会增加pH值并生成 NH4+，溶液中NH3的释放对细菌生长有负面影响。此外，在酵母和尿素培养基中的三个样品的前2 ~ 3h记录了一个约82 μW的小但显着的峰，峰面积相当于第一次和第二次测试，因此可以对应于孢子萌发。 如图3d，由于初始孢子浓度不同，热峰随时间增加，但每个峰的面积相同，表明每个样品产生的总热量相似，最终达到相同的细胞浓度。培养三天后，内生孢子在水凝胶样品中开始显示热曲线。水凝胶量最高的样品在72h左右首先出现，然后水凝胶量第二高的样品开始放热，最大热流也在70 μW左右。这是证明细菌内生孢子被封装在水凝胶内，可以被激活以发芽和生长的直接证据。  图3（a）球形芽孢杆菌孢子内悬液从104 ~ 109 cells/ml连续稀释时的热流模式；（b）不同培养基的孢子内悬液（109 cells/mL）；（c）酵母+尿素培养基和酵母培养基中的孢子内悬液（109 cells/mL)；（d）酵母+尿素培养基中的孢子内悬浮液和孢子内水凝胶。 （4）球形芽孢杆菌在水凝胶内沉淀 CaCO3 通过监测尿素-营养物质（UN）介质中尿素水解和硝酸盐还原过程，考察球形芽孢杆菌在水凝胶内沉淀CaCO3的能力，具体反应式如图4。结合图5a~b可知，悬浮液中的游离内生孢子在培养过程中表现出非常强的脲酶活性和硝酸盐还原能力。尿素水解和硝酸盐还原在组合介质中能够同时被激活，且两个过程不会相互影响，同时活化这两种工艺可以提高整体CaCO3沉淀。在图5c~d中，水凝胶中的内生孢子的尿素水解和硝酸盐还原的反应速度显著降低。这是因为细菌被困在水凝胶内，水凝胶的化学结构阻碍营养吸收和细菌生长，对细菌活性产生了负面影响。而且在UN培养基中额外添加了Ca2+，对细菌活性也有抑制作用，但在培养14天后仍可完成反应，最终结果与悬浮液中的游离内生孢子相当。在图5e~f中，整个14天的测试期内，UN培养基中没有发现NH4+的增加，这说明纯水凝胶中没有发生尿素水解。但仍然检测到少量的NO3−还原及NO2−的积累，这可能是由于水凝胶粉末未消毒，给介质带来了一些污染。  图4 球形芽孢杆菌生成碳酸钙沉淀的反应式  图5 在UN培养基中生长的（a–b）内生孢子悬浮液的脲酶活性和硝酸盐还原能力；（c–d）UN培养基中水凝胶的内生孢子；（e–f）在UN培养基中生长的纯水凝胶（阴性对照）。 （5）裂缝区的氧气分布 如图6所示，砂浆表面的O2饱和度在24h的培养过程中发生了显着变化。裂缝表面的平均初始O2浓度在0h，约为68/% air sat。4h后，整个砂浆表面的 O2消耗量增加，从砂浆的一侧开始，平均数值降至35/% air sat。在12h时，O2不断减少，直到在裂口处检测到极快的O2消耗，如图中标记的矩形区域所示，该区域的平均值为21.5/% air sat.。24h时，裂缝口附近的O2浓度持续下降至19.5/% air sat.左右。其中，ImageJ中提取了裂缝带中三个感兴趣区域的动态变化（图6（2）），每个区域的平均值从59 ± 2/% air sat 开始呈现整体下降趋势,这些区域中氧气浓度下降了66%。 对比对照砂浆，如图7（a1-a2）所示，对照砂浆的表面，在0 ~ 24h未检测到O2饱和度的变化。而在砂浆表面检测到的O2浓度下降是由于细菌活性，裂缝口附近的O2饱和度的损失进一步证明该区域存在较强的细菌活性。纯水凝胶（C + P）试样的O2饱和度没有降低（图7（b1-b2）），虽然水凝胶在一定的pH值下可以吸水，但与细菌耗氧相比，水凝胶吸水引起的氧还原可以忽略不计。随着营养物质（C + N）的加入，砂浆中的O2饱和度也有所降低（图7（c1-c2）），在24h后，砂浆表面的平均氧饱和度从79/%降低到51/% air sat。这一结果可能是水中或砂浆中存在活微生物的污染。基质中营养物质的分布导致微生物在砂浆表面积聚，从而消耗氧气。  图6 在0、4、12和24h包含封装的球形芽孢杆菌的砂浆表面中氧气浓度的分布和动态  图7 （a1-a2）对照砂浆（C）中0 ~ 24h氧气浓度的分布和动态;(b1-b2)对照砂浆+纯水凝胶（C + P）；（c1-c2）对照砂浆+养分（C + N）。 总结 采用多学科研究技术，通过微量热分析和光学氧传感系统，证明了脲酶和硝酸盐还原球形芽孢杆菌在保护性水凝胶和砂浆中的细菌存活和代谢反应。结果表明，球形芽孢杆菌在UYE培养基中培养三天后，水凝胶中的内孢子可以被激活萌发和细胞生长。砂浆裂缝口附近的氧气浓度降低了66%，这表明球形芽孢杆菌在被掺入砂浆后可以被激活并利用氧气进行代谢活动。 本期编者简介 翻译： 陈 仓 博士生 深圳大学 审核： 耿松源 博士生 深圳大学 排版： 赵泰淇 硕士生 深圳大学 本期学术指导 何 闯 博士后 深圳大学 龙武剑 教 授 深圳大学 文献链接： https:///10.1016/j.cemconcomp.2021.10 4006 |
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