设计应用实例
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引言 近年来，生物体内重要的活性分子的可视化是医药分析领域的研究热点, 相比于其它检测技术，小分子荧光探针因具有高灵敏度、高专一性、可实时进行复杂生物系统内生物分子监测及成像的优点而受到重点关注。随着双光子显微技术的发展以及双光子染料的不断开发, 双光子成像技术已成为研究生命科学的重要工具双光子成像技术由于可实现长波长激发从而具有高分辨率、强组织穿透性以及低的组织自发荧光干扰等显著的优越性, 可进一步进行细胞、组织切片、活体斑马鱼以及老鼠成像，获得更好的实时3D 观测与成像效果，推动了生命科学、生物医学以及药学的发展。
ICT 机制荧光探针是由识别基团(供电子基团或吸电子基团)和荧光基团通过共轭基团连接从而形成的D-π-A 共轭体系，在外界光的激发下，荧光分子中的电荷从供电基团(供体)向吸电基团(受体)转移，这一过程就是ICT(图1), 当该探针与被检测物相互作用后会引起探针中吸电基团(供电基团)的吸电能力发生改变时，分子内电荷分布发生变化(即ICT 增强或减弱， 同时通常伴随着紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱发生蓝移或红移。
图1 1,8-萘酰亚胺(图2，化合物1)作为典型的D-π-A 双光子荧光染料,具有光稳定性、大斯托克斯/反斯托克斯位移等优点，目前被广泛应用于生物体可视化、有机光电材料等研究领域。目前，许多文献报道了基于ICT机制的1,8-萘酰亚胺类荧光探针， 这类探针通过荧光关-开、开-关或者比率响应等信号变化来检测被分析物，同时可对生物样品内的活性分子进行双光子成像。
图2 设计应用实例 据文献报道过量的内源或外源性H2O2可与溶酶体中的亚铁离子产生羟基自由基从而损害细胞，为了检测细胞溶酶体内的H2O2 含量，Lin 课题组研发了一种快速响应的溶酶体靶向的双光子H2O2 荧光探针2(图4)，该探针具有吗啉基团, 可作为溶酶体靶向基团，能够有效地监测细胞溶酶体内的内源或外源的H2O2浓度。
过氧硝酸盐(ONOO－)作为一种高活性的RNS，可参与到硝化酪氨酸信号中，同时，由于它能硝化脂质、蛋白质以及DNA 从而被认为是有毒物质。Tang课题组报道了双光子荧光ONOO－探针3(图4). 作者利用吸电子基团酰胺基团抑制ICT 过程导致探针荧光淬灭，当探针与ONOO－反应后, 释放出4-氨基-1,8-萘酰亚胺染料，ICT 抑制消失，荧光恢复。该探针的荧光强度与ONOO－的浓度呈线性关系，对ONOO－专一性好，细胞毒性低。随后，作者利用探针5 进行活细胞中外源性ONOO－的检测，并且利用双光子特性证明了ONOO－是药物导致肝组织损伤的生物标记物。
甲醛(FA)作为RCS中最小的一类活性分子，是公认的致癌物质。Zhu 课题组报道了一种新型双光子荧光探针4(图5) ，他们通过达夫反应在4 位羟基引入醛基，随后引入homoallylamino 基团(FA 识别基团)，当FA 与探针4 反应后, homoallylamino 上的氨基先与FA生成亚胺，随后发生aza-cope 重排，水解后变成强吸电基团醛基。ICT 效应降低，最佳紫外-可见吸收峰与荧光发射波长均发生蓝移。在PBS 缓冲溶液中，探针4 荧光强度与FA 浓度之间具有良好的线性关系，其它RCS 以及相关生物活性分子干扰小，适合在中性条件下进行FA 检测。经实验证明，探针4 细胞毒性小，在激发波长为820 nm 下可用于HeLa 细胞以及活体斑马鱼甲醛FA 成像研。
图5
近年来，由于双光子成像技术的高速发展以及1,8-萘酰亚胺具有易合成、光稳定性好、大/反斯托克斯位移等优点, 以1,8-萘酰亚胺为母核的双光子探针发展迅速,本文介绍了1,8-萘酰亚胺类荧光探针在生命科学、疾病诊断、等领域中的设计理念以及双光子成像应用。当然，现有的1,8-萘酰亚胺类荧光染料也有些许不足，主要体现在: (1)发射波长往往在黄光波段，组织穿透能力不够强，限制了该染料在更深层次组织中成像的应用；(2)萘环部分多取代基的研究较少；限制了染料的应用谱；(3)溶解度较差，限制了部分探针在细胞成像中的应用。因此，把握1,8-萘酰亚胺双光子特性，开发荧光性能更加优异的1,8-萘酰亚胺类荧光探针，将是双光子成像领域中的研究热点。 Ref: 1.Tang,Y.;Lee,D.;Wang,J.;Li,G.;Yu,J.;Lin,W.;Yoon,J.Chem.Soc.Rev.2015,44,5003. 2.Ren,M.;Deng,B.;Wang,J.Y.;Kong,X.;Liu,Z.R.;Zhou,K.;He,L.;Lin,W.Biosens.Bioelectron.2016,79,237. 3.Li,Y.;Xie,X.;Yang,X.;Li,M.;Jiao,X.;Sun,Y.;Wang,X.;Tang,B.Chem.Sci.2017,8,4006. 4.Xie,Z.;Ge,J.;Zhang,H.;Bai,T.;He,S.;Ling,J.;Sun,H.;Zhu,Q.Sens.Actuators,B2017,241,1050.
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