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凌恩生物重磅推出HiFi-meta技术服务，三代宏基因组测序组装方案全新升级！获得完成图水平的MAGs，助力更全面的功能基因挖掘，深耕可移动基因单元-宿主关系，欢迎广大微生态领域研究用户垂询。 
一、研究背景 养鸡业是我国畜牧业的重要产业，鸡肠道微生物群对宿主健康和生长有着显著的影响，既往的研究已经构建了数万个鸡肠道宏基因组组装基因组（MAG）。然而，由于短读长测序和组装技术的局限性，大多数MAG的质量较低，且包含污染reads。 二、研究方法 选取30只42天龄的岭南黄肉鸡，分别从十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠5个肠室采集150份食糜样本，进行HiFi宏基因组测序。 三、研究结果 十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠的HiFi reads如下表所示(表1)。HiFi reads的N50长度为17 kb左右。5个肠段初步组装的contig N50大小均在28kb以上。相比之下，短读长宏基因组的N50大小通常小于10 kb，这表明HiFi reads在contig连续性方面有实质性的改进。此外，覆盖深度与单碱基质量值正相关，表明较高的覆盖深度会提高序列的精度。   从5个肠段中分别得到了27、40、62、285和334个中等质量的MAGs(图3A)。分别在菌株和种水平组装了461和337个MAGs，其中53%和55%是环状的。环状MAGs checkM评分也更高(图3B,C)。研究发现较高的覆盖深度与checkM完整性评分呈正相关，表明覆盖深度的提高有利于组装出更精准的MAGs。 宏基因组中质粒比宿主基因组更难组装。本研究分别识别出61、67、71、81和78个环状质粒基因组。此外，还鉴定到33、14、14、52和50个环状病毒基因组。  在原核生物中，rRNA和tRNA基因的鉴定是衡量基因组完整性的重要手段。研究者对461个MAGs中的rRNA和tRNA基因进行注释，发现439个(95%)基因组是“RNA完整”的，同时满足rRNA和tRNA标准。大多数MAGs有1到6个rRNA操纵子(图4A)和35到65个tRNA基因拷贝(图4B)。此外，环状基因组中rRNA操纵子和tRNA基因的数量更多。 本研究发现的461个菌株水平MAGs中有384个(83%)是新基因组，包括209个(45%)环状基因组和175个(38%)非环状MAGs(图5A)。与已报道的种水平MAGs相比，本研究的337个种水平基因组中有89个(26%)是新基因组，包括50个(15%)环状基因组和39个(12%)非环状MAGs(图5B)。由于样本量的限制，目前HiFi组装的MAGs比短读长组装的少，但质量明显优于短读长MAGs，基因集的完整性也更高，通过与已发表的两个短读长基因集比较，发现HiFi基因集中有大量的新基因。如图5所示，HiFi组装的微生物基因组平均contig数更少、基因组更长、完整度更高、污染程度更低。  使用GTDB-Tk将HiFi组装的种水平MAGs与GTDB数据库中的47894个物种簇进行比对、分类学注释。其中，只有1个MAGs被注释为古菌，其余336个MAGs均属于细菌。优势门为厚壁菌门，其次为拟杆菌门和放线菌门，这3个门总共覆盖了317个(94%)MAGs。 前肠由十二指肠、空肠和回肠组成，主要负责饲料的消化和营养物质的吸收。后肠包含盲肠和结肠，它们的功能是发酵、解毒和回收残余的水和盐。前肠和后肠之间的微生物组成有明显的差异。前肠高度富集的5个属:Ligilactobacillus、limmosilactobacillus、乳酸菌、魏斯氏菌和肠球菌。相比之下，后肠的物种多样性更高。因此，对所有肠段进行分析有利于全面了解肠道微生物。  通过GTDB-Tk注释，发现部分MAGs在科、属和种分类学水平上无法进行分类，这表明它们可能是一些新的菌，可能在工业或医学领域有潜在的价值。近年来，乳酸菌及其近亲Ligilactobacillus和Limmosilactobacillus被广泛用作益生菌补充剂，本次组装的2个Ligilactobacillus基因组和1个Limmosilactobacillus基因组还没有注释到种水平，表明这3个基因组可能为益生菌的发展提供了新的基因资源。使用核糖体数据库(RDP)进一步对这些低分类学级别的基因组进行分类，发现这些基因组中有9个和49个可能分别对应于新的属和种，这拓宽了人们对微生物世界的认识。此外，这些新发现的属中约有1 / 3，新发现的种中约有一半没有在短读长MAG数据中发现，这表明它们仅来自HiFi宏基因组数据，进一步显示了HiFi测序在宏基因组研究中的优势。 四、研究结论 HiFi 测序显著提高了宏基因组组装质量，也恢复了以前基于短读长的宏基因组研究中遗漏的大部分新基因组，本研究获得的新基因组和物种将促进肠道微生物组和宿主-微生物群相互作用研究，从而促进家禽资源的可持续发展。 |
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