如何使用微量移液器

“ 移液是所有分子生物学实验的基础，精准且高重复性的移液操作是生物实验重复性的基石。”

微量移液器（气体活塞型），大家都习惯叫它移液枪或者枪，它对于生物实验员的意义，就像枪之于战场上的士兵，可以说移液器就是我们的生命。能否熟练、正确地使用移液器，直接决定了你的实验结果是否可信，是否具有高重现性。遗憾的是，就我个人这么多年经历的、观察到的，能够完全正确使用移液器的研究生其实并不多，很多人对移液器使用过程应该注意的细节完全没有概念，尽管理论上这是每个人必须掌握的基础技能。在本文中，我将详细的叙述移液器使用中的注意事项，以及移液器的维护和保养。

1 常规移液步骤（正向移液）

1. 常规移液从选择正确量程的移液器开始，原则是使用大于等于你所需体积的最小量程移液器。以eppendorf系列的移液器为例，一共有五个常用型号，最大量程分别为1000，200，100，20，10，2.5微升。确定需要移液的体积之后，选择左边一个刚好大于该体积的移液器。使用1000量程吸取300，100量程吸取80，10量程吸取3都是合适的，但是用100量程吸取19，20量程吸取5都是不正确的。
   

2. 接下来的关键步骤是调整移液体积。翻开任何一本移液器的说明书，都明确写了调节移液器量程必须从大量程向小量程调节。如果起始数值低于所需值，则必须要将量程调节到大于所需值再向下调节；如果向下调过了，也必须再调到大于所需体积之后重新向下调节。这背后的原理称为机械回转差，任何使用机械齿轮传动的场景都适用此原则，原因是任何现实世界中的齿轮之间都无法精密咬合。生活中常见的另一个情境是机械旋钮式微波炉，也应该先转过所需的量再从大向小调节，如果直接从零调节到一个很短的时间例如0.5分钟，不但时间不精确，甚至会导致结束时不能激发“叮”声。
   例：起始值1000，需要使用500，则直接向下调节至刚好500；起始值500，所需值1000，则调至>1000再向下调至刚好1000，如果不小心调到995，则再调至>1000后调至刚好1000。
3. 装配移液头。这一步视不同移液器要分开讨论，但通用原则是不能向下砸枪来保证气密性。对于大部分没有弹簧限位系统的移液器，对准枪头垂直向下用力的同时小角度旋转移液器即可保证气密。对于eppendorf Reference 2系列等有弹簧限位的移液器，移液器对准枪头之后垂直向下用力至弹簧限位处即可保证每次上枪头都有均匀一致的密封。
4. 将活塞推至第一档底部，将枪头尖端伸至液面（以常规情况水溶液为例）下约1~2 mm处，在确保枪竖直的情况下缓缓松开活塞一档停留1~2秒或直至液面稳定。
   常见的错误包括：将枪头伸入液体之后再推活塞吹泡泡；将枪头过度伸入液体中，这对于转移粘度高、易挂壁的液体（含高浓度甘油的酶溶液）是致命错误，特别是小体积移液时，这时枪头外壁粘连的液体甚至比枪头内部的体积还要大；松开活塞过快，导致倒吸、液体飞溅以及体积错误；枪不垂直，这在使用大体积移液器（1000微升，5000微升）的时候是关键错误，可能导致漏液和体积不准。
5. 将枪缓慢转移至移液目标处，将枪头抵在容器侧壁，或者目标液面下越1~2 mm处，缓缓推出液体，停1~2秒观察到大部分液体都已经排出后，推至第二档活塞并迅速移开枪头。转移黏稠溶液时可以在推出第一档之后反复吹打几次润洗枪头，确保所有溶液都能转移。
   常见的错误包括：转移枪的时候动作太快或者没有保持垂直，这有可能导致液体在枪头内部发生飞溅污染枪或者漏液，特别是使用大体积移液器转移高密度液体时（氯仿等）特别容易将液体甩出；悬空放液，可能导致液体飞溅或者因为静电作用发生损失；起始溶液和放液目标之间距离太远，这无疑增大了液体意外漏出的概率，特别是吸取高密度溶液时极易发生。正确的操作是尽可能缩短移液的距离，尽量使用单手握持源和目标离心管并使它们足够靠近。
6. 缓缓松开活塞，将枪移至垃圾桶上方，推出枪头丢弃。如果是Reference系列移液器，保持活塞位于二档底部的同时将枪移至垃圾桶上方，直接按到底推出枪头丢弃。致命错误：突然松开活塞或者丢弃枪头时动作过大。如果枪头尖部存在残余液体，突然松开活塞或者甩枪会导致液体强烈飞溅污染枪内部。凡是转移过有颜色液体的，利福平溶液或者电泳上样缓冲液等，看一看枪顶部就会明白。
7. 移液操作的总原则是尽可能缩短移液距离，每次移液都要关注吸液体积是否准确到位，放液是否完全（如果放液过程最后排出的是气泡说明吸液不足），避免出现吸空、少吸的现象。以及尽量减少气溶胶和飞溅，防止样品之间的交叉污染。
   
   
   

2 特殊情况注意事项以及反向移液

理想情况下微量移液器只能用于转移无腐蚀性、无挥发性、非强酸强碱、粘度较低的水系溶液。但在现实世界中，不可避免需要转移高挥发性、腐蚀性液体，包括乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、己烷等有机溶剂，高粘度液体包括Triton X-100、甘油等，需要特别注意。

1. 挥发性有机溶剂移液时，如果直接按照正向移液法，由于这些液体饱和蒸气压高，会在枪头内部空间制造正压导致严重漏液，是无法准确移液的。解决方法很简单，在正式移液前将枪头在溶液中反复吹打润洗几次，使枪头内部有机溶剂蒸气饱和即可平衡内外压力。

   充分润洗之后还可以配合反向移液技巧。反向移液将活塞推至第二档底部，缓缓松开全部活塞，放液时只放到第一档底部即可。需要注意的是，不润洗只使用反向移液是无效的。但是，反向移液是我非常不推荐的移液方法，由于放液之后残余较多液体，而丢弃枪头之前需要松开活塞，这会导致非常容易倒吸污染。

2. 另一个不推荐使用反向移液的原因是，尽管很多protocol都推荐使用反向移液转移极高粘度液体例如纯甘油和Triton，但其实这两种液体根本就不应该使用微量移液器，即使使用反向移液法误差也是不可接受的。

   正确的做法是，根据密度计算相应体积的质量，使用精密天平直接称量所需的质量，配成稀溶液（50%体积比例以下）储液后再使用微量移液器正常移液即可。不要试图使用容量瓶定容，转移液体时只要挂壁一点点就无法准确定容了。

3. 经常使用有机溶剂的移液器可能导致硅脂密封失效，导致漏气或者活塞生涩，请参考第三部分进行维护。

4. 对于特别脆弱的样品（叶绿体线粒体等完整细胞器，基因组DNA等易受溶剂剪切力伤害的样本）或者粘度比较高的液体，可以使用大开口移液头，或者用刀片剪刀手动扩大开口。

3 移液器维护和保养

1. 正常情况下一般一年需要校准一次移液器，校准可以交给公司或者自己操作，不过自己校准需要花费不少时间和相当多的耐心。如果在移液过程中发现异常漏液或者刻度不准（使用带刻度枪头时），继续使用这样的移液器是对你的实验结果不负责任，要立刻检查维护。

2. 维护时将移液器拆开，检查活塞处硅脂是否干涸，如果干燥将就硅脂擦掉，均匀涂抹一薄层新鲜的真空硅脂，装好后按压几次活塞检查是否顺滑，用水和精密天平检查移液器准确性后才能使用。
   

3. 如果发生倒吸，立即清洗移液器。将移液器头部拆卸，移除弹簧和活塞，根据污染类型只清洗前面塑料部分。如果是细菌污染可以用超纯水冲洗之后再用75%乙醇清洗并晾干，如果是非水溶化合物飞溅导致的，用对应的强溶剂清洗后立即吹干，避免长时间接触有机溶剂。

4. 移液器需要无菌时，请参考说明书进行整支或者部分高压灭菌。普通的微生物操作一般紫外灯照射和75%乙醇表面灭菌就足够了。推荐使用带过滤膜的枪头，既可以防止有菌空气污染样品，也可以防止微生物溶液污染枪内部。

5. 清洁移液器外壳时，一般用水和75%乙醇溶液效果就很好，如果需要清除顽固的黑色油污，可以用布蘸稀氢氧化钾溶液进行擦拭。氢氧化钾溶液对皮肤有腐蚀性，务必戴手套注意防护。
   

6. 移液器特别怕摔，使用时务必小心。高处掉落可能导致齿轮部分出现错齿现象，主体部分变形也可能导致漏气，或者枪头无法密封。