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蒋林林钱宇洪凌嘉李亭廷杜习慧  （重庆师范大学生命科学学院，重庆 401331） 摘 要交配型是调控真菌子实体发育和生活史的重要因子。作为羊肚菌生活史中一个有争议的阶段，菌核与交配型的关系研究甚少。以六妹羊肚菌Morchella sextelata和梯棱羊肚菌M. importuna为研究对象，以栽培菌包内的菌核和实验室单孢交配产生的菌核为研究材料，以Morchella sp. Mes-20单孢交配产生的菌核为参考，进行交配型分析。结果发现：1）菌核的交配型呈明显的偏分离现象，六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌中交配型为MAT1-1的菌核远多于交配型为MAT1-2的菌核，而Morchella sp. Mes-20中MAT1-2菌核较多于MAT1-1的菌核；2）部分菌核含有2种交配型，但无法确定菌核是由异核体可育菌丝还是由2个交配型的单倍体不育菌丝缠绕组织化形成；3）部分菌核既不具有MAT1-1,也没有MAT1-2，出现交配型全部缺失现象。交配型缺失在羊肚菌菌种退化检测中的应用值得探寻，而羊肚菌菌核的偏分离和交配型缺失的机制及其与菌种选育和子实体产量之间的关系也有待深入研究。 关键词 生活史；交配试验；栽培菌包；偏分离；交配型缺失 羊肚菌属Morchella Dill.: Pers.真菌隶属子囊菌门Ascomycota、盘菌目Pezizales、羊肚菌科Morchellaceae[1]。该属物种丰富，广泛分布于北半球温带地区[2]，在我国多数地区俗称羊肚菌。该属真菌子实体营养丰富，含有多种活性物质[3-8]，国内外市场上备受欢迎。自20世纪80年代Ower于室内栽培羊肚菌成功后[9]，有关羊肚菌驯化栽培的研究一直在不断进行。在我国，赵琪等[10]以圆叶杨为基质实现了羊肚菌的仿生栽培，并获得羊肚菌商品化菇。2011年至今，随着添加外源营养袋的羊肚菌农田栽培技术的发明[11]，羊肚菌栽培技术得以快速发展[12-17]，也使羊肚菌的人工栽培在食用菌产业中异军突起，成为我国精准扶贫和乡村振兴的重要支柱。较高的经济价值、独特的生物学特性以及亟待解析的生活史特征，让羊肚菌成为国内目前食用菌研究领域的热点之一。在羊肚菌的生活史中，菌核是一个争议不休的话题。菌核是由真菌菌丝生长到一定阶段组织化形成的一种颜色较深的致密坚硬菌丝体结构，能够抵御外界不利环境，具有高度多变的形态特征[18]，其结构由外向内依次是外皮层、皮质和髓质[19]，富含脂类和多糖[20-21]。由于缺少外皮层和髓质，羊肚菌的菌核并不是真正意义上的菌核，只是由菌丝重复分支和膨大形成[22]。因此，准确的说，羊肚菌的菌核是未分化的假菌核。尽管“菌核”和“假菌核”具有不同的发育和解剖特征，但是，考虑到二者功能的相似性，以及“菌核”一词在羊肚菌研究中的广泛使用[22-31]，为了方便理解，本文采用“菌核”一词来指代羊肚菌的“假菌核”。1904年，Molliard[32]报道了羊肚菌的菌核，但菌核在羊肚菌生活史中的作用一直不清楚。有学者认为羊肚菌的子实体是由菌核萌发而成，菌核的有无与出菇息息相关，如：Ower等[9]认为羊肚菌的生活史以菌核为中心，菌丝形成菌核，菌核萌发再由菌丝扭结成原基；Volk等[26]认为菌核是羊肚菌子实体形成过程中的重要阶段，而Mashphay[33]报道利用菌核萌发形成羊肚菌子实体，刘奇正等[24]报道羊肚菌在菌核上直接形成原基。然而，也有学者认为菌核有无与出菇及产量高低没有关系，如：赵永昌等[34]提出不同物种的菌核形成能力差别较大，菌核可能并不是羊肚菌属所有物种生活史的必须阶段；贺新生等[35]认为菌核的有无与出菇与否及产量高低之间没有必然的联系；多数种植者认为栽培种的菌丝长满菌袋并形成菌核后才可以播种，但不少种植户在栽培种仅长满菌丝后就播种，其出菇时间短且产量稳定[36]。有关羊肚菌菌核形成的生理生化条件和形态变化[26,31,34,37-46]、菌核形成过程中基因表达变化[47-49]和活性氧对菌核发育的调控[31,49-51]等方面，国内外学者也开展了很多研究。然而，关于菌核在羊肚菌生活史中的作用一直悬而未决，菌核的形成是否与羊肚菌出菇的关系也尚不可知。真菌的交配型位点（Mating type locus，MAT）是调控真菌交配系统、有性繁殖方式和子实体发育的关键位点[52-54]。基于对羊肚菌属交配型MAT1-1和MAT1-2的研究证实该属有性生殖方式包括异宗配合、假同宗配合和单性生殖3种方式[55-61]。作为最常用的遗传标记之一，交配型基因与食用菌产业的遗传育种研究密不可分，并在很多食药用菌的育种和退化菌株鉴定中得到了广泛的应用，如：羊肚菌、蛹虫草和块菌等[62-70]。同时，研究发现，交配型MAT1-1和MAT1-2在羊肚菌、块菌、蛹虫草等多个真菌类群的自然群体和个体中存在分布不均衡和偏分离的现象[55,57,67,71-73]。林芳灿等[74]指出自然群体中包含的交配型因子的数目和比例能够反映该群体遗传背景的广阔程度，并能为种质鉴定和利用提供良好的参考标准。因此，深入认识交配型在羊肚菌生活史中的分布对于认识羊肚菌的交配系统、生活史、种质鉴定和菌种选育均具有重要的理论指导意义。羊肚菌菌核，作为羊肚菌生活史中争议不休的一个阶段，其交配型的分布一直未有相关研究，那么MAT1-1和MAT1-2在羊肚菌菌核中的分布是否存在差异和不平衡现象？因此，本研究拟以羊肚菌属可栽培物种六妹羊肚菌Morchella sextelata和梯棱羊肚菌M. importuna为研究对象，以2个物种的栽培菌包内的菌核和实验室单孢交配产生的菌核为研究材料，同时纳入黄色羊肚菌Morchella sp. Mes-20实验室单孢交配产生的菌核为参考，分别对这些菌核进行交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1的检测，进而分析交配型在这些菌核内的分布，为羊肚菌的基础研究和人工栽培及菌种选育提供参考。用于交配试验的3株野生羊肚菌及其子囊孢子粉由重庆师范大学提供，样品编号FCNU1113、FCNU1114、FCNU1115，其中样品FCNU1113和FCNU1114分别为黑色羊肚菌支系中的六妹羊肚菌M. sextelata和梯棱羊肚菌M. importuna，样品FCNU1115为黄色羊肚菌支系中的Morchella sp. Mes-20；所采用的8个栽培菌种是来自国内不同地区的六妹羊肚菌M. sextelata（C1，C2，C3，C4）和梯棱羊肚菌M. importuna（C5，C6，C7，C8）的栽培菌种。交配试验所用的培养基均为马铃薯葡萄糖琼脂培养（PDA，Solarbio，China）。分别制备羊肚菌样品FCNU113、FCNU1114和FCNU1115的孢子悬浮液，用血球计数板计数并稀释成500个/mL。配制PDA培养基，121℃灭菌30 min后于超净工作台内倒平板。待培养基凝固后，取80 μL孢子液于90 mm×90 mm平皿涂板，置于20~24℃培养箱内进行倒置培养。在接种20 h后，挑取已萌发的单孢菌丝，转至新的PDA培养基上继续进行培养。培养7~9 d，直至菌丝长满整个平板，在超净工作台内刮取单孢菌丝，进行基因组DNA提取。采用CTAB法提取基因组DNA[55]。提取好的基因组DNA储存于-20℃备用。检测交配型基因的引物详情见表1，参考Du等[55-56]方法并进行相应的改进设计。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 7 min，14℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，具有MAT1-1-1而没有MAT1-2-1扩增条带的单孢菌株的交配型为MAT1-1；反之，具有MAT1-2-1而没有MAT1-1-1扩增条带的单孢菌株的交配型为MAT1-2。表1 羊肚菌属黑色羊肚菌支系和黄色羊肚菌支系交配型基因的扩增引物Table 1 Primer of mating-type genes for Elata Clade and Esculenta Clade in the genus Morchella 1.2.4 单子囊孢子菌株选择、交配试验设计和菌核选取从样品FCNU1113、FCNU1114和FCNU1115选取MAT1-1单子囊孢子菌株和MAT1-2单子囊孢子菌株用于交配试验，并放置室温培养。用于交配试验的单孢菌株及其来源见表2。当MAT1-1菌丝和MAT1-2菌丝接触后，在二者的接触带处，切取1块包含有二者菌丝的培养基块转移至1个新培养基中，室温培养，直至菌核产生。观察培养基不再产生菌核时，在超级净工作台内分别挑选独立生长的单个菌核，转移到1.5 mL的离心管内，用于后续菌核交配型的鉴定。表2 样品及其单孢菌株的交配型和交配试验设计Table 2 Samples and mating-types of single ascospores used in this study and the design of mating experiments 在超净工作台内，从8个栽培菌种的菌包内分别挑选独立生长的单个菌核，并分别转移至1.5 mL的离心管内，用于后续菌核交配型的鉴定。根据文中“1.2.2”和“1.2.3”方法分别对1.5 mL离心管内菌核样品进行DNA提取和交配型基因检测。本研究共选取菌核样品528份，其中384份菌核来自六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的8个栽培菌包，每个菌包分别选择48个独立生长的菌核；另有144份菌核来自六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌和Morchella sp. Mes-20各自MAT1-1子囊孢子和MAT1-2子囊孢子交配试验产生的菌核，分别从六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌和Morchella sp. Mes-20获得52、60和32个菌核（表3）。表3 菌核样品及其交配型Table 3 Samples of sclerotia analyzed in this study and their mating-types 注： a. 菌核分析总数；b. 含MAT1-1菌核数量；c. 含MAT1-2菌核数量; d. 含MAT1-1和MAT1-2菌核数量；e. 未检测到MAT的菌核数量；f. MAT1-1菌核∶MAT1-2菌核 Note： a. Total numbers of analyzed sclerotia；b. Numbers of sclerotia harboring MAT1-1；c. Numbers of sclerotia harboring MAT1-2; d. Numbers of sclerotia with both MAT1-1 and MAT1-2 undetected；e. Numbers of sclerotia with both MAT1-1 and MAT1-2 undetected; f. MAT1-1 sclerotia∶MAT1-2 sclerotia 基于对528份菌核进行交配型基因检测结果分析，研究发现：（1）来自六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌和Morchella sp. Mes-20的菌核的交配型，共有4种类型，分别是：交配型为MAT1-1的菌核；交配型为MAT1-2的菌核；交配型为包含MAT1-1和MAT1-2菌核；没有检测到MAT1-1和MAT1-2的菌核；（2）对于六妹羊肚菌，无论是由交配试验产生还是从栽培菌包获取的菌核，交配型为MAT1-1的菌核均远多于交配型为MAT1-2的菌核，MAT1-1菌核∶MAT1-2菌核最小比值为1.5∶1，而最大比值为45∶0，其中栽培菌包C2的测试菌核中全部为MAT1-1菌核，出现MAT1-2菌核缺失而MAT1-1菌核占绝对优势的现象，同时，在六妹羊肚菌中还检测到含有MAT1-1和MAT1-2的菌核，其所占的比例为4.1%，以及没有检测到交配型的菌核，其所占的比例为7.8%，即在六妹羊肚菌中发现部分菌核出现交配型缺失的现象；（3）对于梯棱羊肚菌，在取自其交配试验和栽培菌包的菌核中，交配型为MAT1-1的菌核也远多于交配型为MAT1-2的菌核，MAT1-1菌核∶MAT1-2菌核最小比值为1.3∶1，而最大比值为17∶1，尽管没有发现MAT1-1菌核占绝对优势的现象，但是MAT1-1菌核相对于MAT1-2菌核仍然呈现明显的优势，同时也检测到含有MAT1-1和MAT1-2的菌核，其所占的比例为4.4%，而没有检测到交配型的菌核所占的比例为15.1%，即在梯棱羊肚菌中部分菌核也出现交配型缺失的现象，并且相对于六妹羊肚菌，梯棱羊肚菌表现出更高的菌核交配型缺失的比例；（4）对于Morchella sp. Mes-20的菌核，交配型为MAT1-2的菌核却多于交配型为MAT1-1的菌核，MAT1-1菌核：MAT1-2菌核的比值为1∶3.8，相对于MAT1-1菌核，MAT1-2菌核在Morchella sp. Mes-20中呈现一定的优势，同时，在Morchella sp. Mes-20中检测到含有MAT1-1和MAT1-2的菌核的比例为3.1%，而没有检测到交配型的菌核的比例为6.3%，即在Morchella sp. Mes-20中部分菌核出现交配型缺失的现象。交配型位点是真菌交配系统、性别特征、有性繁殖方式和子实体发育重要的调控位点[52-54]。开展交配型位点及其相关基因的研究对于认识真菌有性生殖、生殖类型转化、子实体发育和菌种选育等具有重要的科学理论意义和应用指导价值。交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1不仅调控真菌的有性生殖方式，而且还影响真菌的其他功能，如：真菌的致病性[75]、毒性[76]、细胞转化[77]和细胞壁完整性[78]等。国内外多项研究报道，真菌交配型MAT1-1和MAT1-2在自然界的分布中呈现出不平衡和不均的现象，如：蛹虫草Cordyceps militaris[79]，新生隐球菌Cryptococcus neoformans[80]，小麦壳针孢叶枯菌Mycosphaerella graminicola[81-82]，致病疫霉Phytophthora infestans[83]和黑孢块菌Tuber melanosporum[71]，并发现这些真菌交配型所呈现出来的差异分布和区域竞争性与其关联的致病性、毒性或生态习性等功能可能有关。在羊肚菌属真菌中，Du等[55]报道了MAT1-1和MAT1-2 2个交配型在野生羊肚菌子实体和自然群体中所出现的分布不平衡的现象，但是羊肚菌交配型在自然界呈现差异分布的原因尚不清楚。作为羊肚菌生活史中有待商榷的一个阶段，羊肚菌菌核的交配型分布一直未有报道，本研究通过对六妹羊肚菌M. sextlelata和梯棱羊肚菌M. importuna的栽培菌包和交配试验产生的菌核的交配型分析发现，与Du等[55]所报道的交配型MAT1-1-1在羊肚菌野外群体中呈现出优势分布的现象一致。2个物种中交配型为MAT1-1的菌核远多于交配型为MAT1-2的菌核，尤其是栽培菌包C2的菌核呈现出MAT1-1绝对优势的现象。李小凤等[84]对蛹虫草子囊孢子单孢菌株的交配型鉴定发现蛹虫草的交配型也呈现出偏分离现象，MAT1-1∶MAT1-2的比例是78∶45，MAT1-1具有较明显的优势。然而，对Morchella sp. Mes-20的菌核交配型分析发现，尽管该物种菌核的交配型也呈现出一定程度上的分布不平衡的现象，但是该物种MAT1-2交配型的菌核较多于交配型为MAT1-1的菌核，且MAT1-1∶MAT1-2的比例是1∶3.8。相对于MAT1-1交配型，MAT1-2在Morchella sp. Mes-20呈现出一定的优越性，这与六妹羊肚菌M. sextlelata和梯棱羊肚菌M. importuna的研究结果不同。高扬等[85]对40株蝉棒束孢菌株的交配型进行鉴定，发现MAT1-1∶MAT1-2的比例是7∶13，尽管在该研究中并没有出现某一种交配型占绝对优势的现象，但是交配型为MAT1-2菌株明显多于MAT1-1菌株。MAT1-1和MAT1-2在羊肚菌属物种间呈现出的优势差异性有待进一步的研究。其次，本研究在六妹羊肚菌M. sextlelata、梯棱羊肚菌M. importuna和Morchella sp. Mes-20 3个物种的菌核样品中均检测到少量菌核同时具有MAT1-1和MAT1-2 2种交配型。一直以来，有学者认为羊肚菌的菌核可以由可育菌丝扭结组织化形成，并在适宜的条件下，菌核萌发形成可育菌丝并进而发育成子实体[9,27]，然而并没有直接的证据证明菌核是由可育菌丝组织化形成的。Frazer[86]认为菌核是由营养菌丝而非可育菌丝形成。尽管本研究检测到少量菌核含有2种交配型，但是由于无法确定这些菌核是由异核体可育菌丝（菌丝细胞包含有MAT1-1和MAT1-2两种细胞核）组织化形成，还是由单倍同核体的MAT1-1菌丝和单倍同核体的MAT1-2菌丝缠绕组织化形成，因此，本研究依然无法解析羊肚菌的菌核是否可以由可育菌丝扭结形成这个问题。再者，本研究在3个物种中均有少量菌核未检测到交配型MAT1-1-1和MAT1-2-1，即3个物种均有部分菌核出现2个交配型基因全部缺失的现象。交配型基因缺失，作为食用菌领域用于菌种选育和菌种退化鉴定的一种方法，在蛹虫草等真菌中也有报道[62,84,87]。汪虹等[62]研究发现在蛹虫草的退化菌株中，有些菌株缺失MAT1-1交配型，有些菌株缺失MAT1-2交配型，尽管蛹虫草交配型基因缺失的原因尚不清楚，但是在蛹虫草的继代培养中出现交配型缺失的确是时有发生的。李小凤等[84]推测在蛹虫草的继代培养中，随着继代培养的传递，交配型MAT1-2会逐渐缺失，从MAT1-1∶MAT1-2理论比例1∶1直至不含MAT1-2交配型。对于羊肚菌属真菌来说，有些子实体的菌柄组织中会出现只有1种交配型基因的现象[55]，这种现象应从交配型在子囊菌个体发育中作用的角度来探讨[57]，而不能以“交配型缺失”来解释[88]，其并不等同于上述蛹虫草等食用菌类群中所述交配型缺失现象。羊肚菌菌株的继代培养过程中出现交配型缺失的现象在羊肚菌菌种退化检测的应用中研究甚少，而羊肚菌菌核的交配型所呈现出的偏分离和交配型缺失的机制，及其与羊肚菌菌种选育、退化菌株筛选以及子实体产量之间的关系也有待深入研究。致谢在此特别感谢湖南师范大学陈作红教授在我们样品采集的过程中给予的大力支持和帮助。DOI：10.13341/j.jfr.2021.1475 引用本文： 蒋林林，钱宇洪，凌嘉，等.羊肚菌菌核的交配型［J］.菌物研究，2021，19（4）：255-262. (JIANG Linlin,QIAN Yuhong,LING Jia,et al.Mating Types of Sclerotia in Morchella[J].Journal of Fungal Research,2021,19(04):255-262.) 作者简介：钱宇洪,女，研究方向：羊肚菌属真菌的生活史研究 通讯作者：杜习慧,E-mail:duxihuimorel@outlook.com 基金信息： 重庆市自然科学基金项目（cstc2018jcyjA3693） 中图分类号： Q949.325；S646 文章编号：1672-3538（2021）04-0255-08 文献标识码： A 收稿日期：2021-11-15 出版日期：2021-12-31 网刊发布日期：2021-12-28
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