为了帮助大家快速了解代谢组学，小 M 今日特地挑选了代谢组学中应用最为广泛也是最经典的 LC-MS 技术来解锁代谢组学实验篇，研究过程可分为研究设计、样本准备、仪器检测和数据分析 4 个主要步骤 (图 1)[1]。
图 1. LC-MS 代谢组学的一般流程图[2]。
一个包含四个重要阶段的 notame 工作流的总体概述
Q：代谢组学出现在生命科学的各个研究领域中，paper 更是数不胜数，我该如何开始设计呢
A：代谢组学更像一种研究技术和方法，实验设计有 2 个关键内容，小 M 给大家列出来了。
1. 明确科学问题并选择合适的代谢组学技术：明确研究的科学问题及目标代谢物，选择合适的检测技术，对后续的研究能起到很好的指导作用。
表 1. 代谢组学技术选择
2. 样本选择与设计
样本的选择通常是个性化的，需要依照具体的研究背景和目的进行选择，而样本设计则有一定的共性：
1）由于代谢组定量一般是相对定量，所以需要设置实验组及对照组
2）每组样本需要设置有生物学重复
接下来终于要开始动手做实验啦，由于代谢物会发生氧化降解，所有实验步骤都需要冰上进行或者低温操作~1. 样本收集与保存：首先各位小伙伴要依据研究背景及实验设计，收集并处理样本，常规样本 (细胞等) 经 PBS 清洗后 4℃ 离心取沉淀，液体样本冷冻离心后取上清，并转到 EP 管中冻存于 -80℃ 冰箱。2. 代谢物提取：每样本加入 1 mL 预冷的提取试剂，震荡后液氮速冻、超声，低温孵育 1 h 以上，随后冷冻离心取上清，这一步的目的是充分沉淀蛋白质并提取代谢物。接下来收集上清液冻干并加入 100 µL 复溶剂，充分溶解后冷冻离心取上清转至 LC-MS 样本瓶待测 (图 2)。3. QC (Quality Control) 样本准备：每样本中取出 10 µL 混合成 QC 样本。
图 2. 血浆样本代谢组提取过程示例[3]
LC-MS 检测仪器多种多样，小伙伴可以根据研究设计与实验条件自行选择。除了需要选择合适的仪器和方法外，还有两点要注意：
1. 样本检测顺序需随机打乱，检测前后需插入空白溶剂样本及 QC 样本，同时 QC 样本也需插入样本序列进行检测，用于柱平衡、质控、并辅助后续的数据分析[4]。2. 除了实验方法、仪器设备及参数存在差异，质谱仪的信号也会随时间发生偏移，即使质谱仪可以定期校准，但我们仍然建议需进行比较的样本组要同一批次上机检测。数据分析可谓是代谢组学研究的 “关键限速步骤” (图 3)，我们可以将它分解成 4 个步骤来完成：1. 原始数据处理：通过基线校正、峰对齐、峰识别、缺失值填充、数据过滤、归一化处理等方式将原始数据中的代谢物信息进行提取并转换成可用于数据分析的形式。2. 统计分析：主要包含单统计分析 (Fold change、T test、Volcano Plot 等) 及多统计分析 (PCA、HCA、PLS-DA 等)，也可辅以机器学习建模的方法，一般是通过寻找差异表达的代谢物从而锁定与研究背景相关的目标物质。3. 代谢物鉴定：目的是将 LC-MS 检测信号匹配到对应代谢物，分为标准品数据库比对和算法预测两种方式[5]。
4. 功能分析："万里长征" 的最后一步，把结果解析好是代谢组的点睛之笔。然而要将功能注释做得尽善尽美，通常还需要结合文献调研与后续实验来确认。不过我们可以先通过通路鉴定，GESA 分析，通路富集分析，网络分析等分析方法找到关键代谢通路与代谢物作为功能分析的切入点。
图 3. 代谢组学数据分析流程[6]
典型的代谢组学数据分析工作流程，包括数据原始处理、统计分析、功能注释等过程。
以上就是一次经典的代谢组学的全部实验流程啦，上期小 M 介绍了代谢组的基本知识和经典案例，错过的同学们可以看一看~
您是不是已经迫不及待的想要开始自己的代谢组学实验呢？小 M 为大家带来了 MCE 代谢组学服务，主要包括非靶向代谢组学和靶向代谢组学两大类，且有专业的代谢组学技术团队为您提供从样品处理到生信分析的一站式服务！
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1. Mahmud, Iqbal, et al. "Decoding the metabolome and lipidome of child malnutrition by mass spectrometric techniques: present status and future perspectives." Analytical chemistry 91.23 (2019): 14784-14791.2. Klåvus, Anton, et al. "“Notame”: Workflow for non-targeted LC–MS metabolic profiling." Metabolites 10.4 (2020): 135.3. Chan, C. Y., et al. "Technology platform development for targeted plasma metabolites in human heart failure." Clinical proteomics 10.1 (2013): 1-9.4. Broadhurst, David, et al. "Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies." Metabolomics 14.6 (2018): 1-17.5. Wandy, Joe, et al. "In silico optimization of mass spectrometry fragmentation strategies in metabolomics." Metabolites 9.10 (2019): 219.6. Chong, Jasmine, Mai Yamamoto, and Jianguo Xia. "MetaboAnalystR 2.0: from raw spectra to biological insights." Metabolites 9.3 (2019): 57.
