01 宿主细胞蛋白(HCP)概述 宿主细胞蛋白(HCP)是与蛋白质生产过程相关的杂质,由用于生产生物药物蛋白的宿主细胞表达,是多种不同蛋白质组成的混合物。在目的蛋白纯化过程中,大部分的HCP被去除(>99%),但仍有HCP与产品共纯化,残留在产品中。这些残留的HCP具有潜在的危害性,可能干扰药物效果或引发过敏反应等。因此需要对原料药和下游纯化过程(DSP)中间体中的HCP进行表征和量化。
HCP示意图 02 HCP检测相关法规要求 HCP残留是工艺稳定性监测的重要评价指标,是重组疫苗及重组抗体类药物的重要质控指标,生物制品中残余HCP含量通常被认为是产品的关键质量属性 (CQA)。诸如FDA和EMA之类的国家法规授权要求必须对生物药品进行分析和纯化,以将宿主细胞蛋白HCP降低到可接受的水平。对HCP的接受程度将根据具体情况进行评估,并取决于多个因素,其中包括:剂量、给药频率、药物类型和疾病严重程度。美国FDA推荐值:1-100ppm(ppm:百万分之一),中国药典明确规定CHO细胞残余蛋白占总蛋白含量要保持在0.05%以下(相当于小于500ppm)。
03 HCP研究面临的挑战 即使是最终药物中少量的宿主细胞蛋白(HCPs)也能产生免疫原性反应; 因此,需要对产品和工艺中间体进行检测。传统的蛋白质检测方法,如高效液相色谱法和总蛋白染色法,不具有HCP检测所需的灵敏度和特异性。优化的免疫分析(ELISA)和质谱(MS)方法更适合于HCPs的测量和表征。
04 HCP检测、鉴定和定量的分析方法
现已有多种分析技术来了解生物过程中存在的HCP 及其丰度,具体如下:
虽然上述单一方法均无法准确、高效的测定HCP,但可以将不同的检测技术组合。如将ELISA与2D-PAGE组合,并使用免疫印迹技术,可以验证ELISA中抗体的覆盖率,有助于提高ELISA方法的准确性。2D-PAGE也可以结合LC-MS/MS
,以此识别特定的 HCP组分,有助于识别高风险因子。
多种HCP检测、鉴定和定量的分析方法对比
05 ELISA应用于HCP检测 开发的早期阶段,可接受通用的商用试剂盒用于检测HCP,但一旦生物制药进入三期临床试验阶段,由于通用试剂盒的抗体覆盖率不足等局限性,就需要一种经过验证的、产品特异性的HCP检测方法。开发这种产品特异性检测方法是一个耗时的过程,涉及多个步骤,包括抗血清生产、抗体纯化、ELISA方法的建立和优化、确认和验证。一般开发方向有三个:通用型检测、平台化检测以及项目专属性检测,这三种方向的对比如下图所示:
不同类型ELISA检测方法比较 |
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