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题目：HY5 functions as a systemic signal by integrating BRC1-dependent hormone signaling in tomato bud outgrowth 刊名：Proceedings of the National Academy of Sciences 作者：Christine H. Foyer and Jingquan Yu et al. 单位：Zhejiang University, Hangzhou 日期：April 10, 2023    01 摘要  光在决定植物结构方面起着重要作用，这极大地影响了作物产量。然而，光信号调节芽生长的确切机制仍有待确定。在这里，我们证明光通过番茄中的 HY5 和油菜素类固醇 (BR) 依赖性途径调节芽的生长。红光光感受器 PHYB 的失活，或 PHYB 或蓝光光感受器 CRY1a 的缺陷，会抑制芽的生长并导致 HY5 蛋白的积累减少和 BRANCHED1 (BRC1) 的转录水平升高，BRANCHED1 (BRC1) 是分支信号的中央整合因子。HY5，作为来自叶子的移动系统信号，通过直接抑制BRC1促进芽长出番茄侧芽内 BR 生物合成基因的转录和激活转录。此外，BRC1 通过直接抑制 CK 合成基因LOG4的转录，同时增加 CK 和 GA 降解基因（ CKX7、GA2ox4和GA2ox5 ）的转录水平，从而阻止细胞分裂素（CK）和赤霉素（GA）的积累，导致阻止芽的生长。此外，由于 HY5 对BRC1转录本的抑制，芽长出主要发生在白天。这些发现表明，光诱导 HY5 在微调番茄芽长出过程中充当系统信号因子。 02 技术路线  Tomato (Solanum lycopersicum) cv. Moneymaker (WT); cv. Condine Red (WT); cv. Ailsa Craig (WT); and the cry1a, phyA, phyB1B2, not, and dwf mutants 生成 pBRC1– LOG4和 pBRC1– CKX7转基因植物\VIGS 和农杆菌介导的病毒侵染 植物激素和蔗糖的测量 总 RNA 提取和 qRT-PCR 分析\RNA-Seq Western Blot\重组蛋白纯化和 EMSA\染色质免疫沉淀 (ChIP)-qPCR 双荧光素酶测定\酵母单杂交试验 In Situ Hybridization 生长条件如下：白光下 12 小时光周期（上午 8 点至晚上 8 点）和温度 25/20 °C（昼/夜），光合光子通量密度保持在 400 µmol m -2 s -1 03 主要结果 3.1 光通过番茄中 BR 依赖和独立途径调节芽的生长。 我们之前曾报道过 BR 信号整合了多种激素和糖途径，以释放番茄的顶端优势 。为了确定 BR 是否介导了芽生长的光调节，八叶期的野生型 (WT) 植物被置于红色/远红色 (R/FR) 比率为 1:0 的三种光质量条件下；分别为 1:1 或 1:2。降低生长环境中的 R/FR 比率可显着提高BRC1转录本的水平并抑制芽长出，如 WT 植物侧枝的数量和总长度减少所示（图 S1）。FR 对芽生长的抑制与编码 BR 合成基因的转录本水平较低有关（DET2和DWF）、芸苔素内酯（BL，主要活性 BR）的积累减少，以及侧芽中 BZR1 蛋白（特别是 BZR1 的去磷酸化活性形式，dBZR1）的数量减少（图 1 A - C ）。 探索 BR 合成和信号在光调节芽生长中的作用，WT 植物， BR 生物合成基因DWF缺陷的dwf突变体，以及BR 信号组分BRASSINAZOLE RESISTANT1 ( BZR1 )缺陷的bzr1突变体在 8-叶期暴露于不同的 R/FR 光比（即分别为 1:0、1:1 和 1:2）。低 R/FR 光比不仅在 WT 植物中而且在dwf突变体和bzr1突变体中抑制了芽的生长并增加了BRC1转录物的水平，尽管这些影响不如 WT 中的显着（图 1D和E 和图 S2 A和B）。这些结果表明，BR 依赖性和 BR 非依赖性信号通路都参与了番茄芽长出的光调节。 接下来，我们检查了光信号是否直接调节芽的生长。phyA（FR 光感受器突变体）增加了侧芽的数量和总长度，并且在白光 (WL) 下BRC1转录物水平较低。双突变体phyB1B2（R 光感受器突变体）减少了侧芽的数量和总长度，同时增加了BRC1转录本的水平（图 1 F和G 和 图 S3 A和B）。此外，蓝光光感受器突变体cry1a与 WT 相比，侧枝的数量和总长度显着减少。相比之下，CRY1a ( CRY1a -OE) 的过表达显着促进了芽的生长。与这一发现一致，BRC1转录本的水平在cry1a突变体中显着高于野生型，在CRY1a -OE 植物中显着低于野生型（图 1 F和G 和 图 S3 A和B）。这表明这些光感受器积极参与芽长出的调控，这与BRC1的变化密切相关番茄侧芽中的转录水平。
3.2 HY5 整合光信号以调节番茄芽的生长。 HY5 是一种基本的亮氨酸拉链转录因子，作用于各种光感受器的下游，并参与调节植物生长和代谢的多个过程。为了研究 HY5 是否在芽长出中起作用，我们检查了不同光照条件下芽中HY5转录物和 HY5 蛋白积累的反应。当 R/FR 比率降低时，WT 植物侧芽中HY5转录物的水平和 HY5 蛋白的积累降低（图 1 H 和 图 S2 C）。而且，相比于WT， HY5的积累转录物和 HY5 蛋白在phyB1B2突变体的侧芽中较低，但在WL 下的phyA侧芽中增加（图 1 I 和 SI 附录，图 S3 C）。此外，与 WT 植物相比，cry1a突变体芽中HY5转录物和 HY5 蛋白的积累低于WT，而CRY1a -OE 芽中 HY5 转录物和 HY5 蛋白的积累高于 WT 植物（图 1C）。 为了检查 HY5 在光调节芽生长中的作用，生成了 CRISPR/cas9 hy5突变体、HY5 -RNAi 和HY5 -过表达 ( HY5- OE) 系并用于以下实验。 与WT 相比，HY5 -RNAi 植物和hy5突变体的侧枝数量和总长度均减少，BRC1转录物水平增加，而HY5- OE 植物的侧枝数量和总长度增加， BRC1水平降低成绩单 (图 2 A –C 和 图 S4 B和C）。 原位杂交分析表明， HY5 -RNAi 植物的腋芽分生组织和叶原基中的BRC1 mRNA 水平高于WT，而在HY5- OE 芽中几乎检测不到BRC1转录本的水平（图 2 D 和 图 S4 D）。此外， RNA 干扰 ( CRY1a -OE* HY5- RNAi)对CRY1a -OE 植物中HY5的转录抑制SI 附录，图 S5 A - D ）或HY5的病毒诱导基因沉默（VIGS）（pTRV- HY5）（ 图 S5 E - I）损害CRY1a -OE 诱导的侧芽生长并增加水平BRC1成绩单。总之，这些发现表明 HY5 作用于这些光感受器的下游，通过抑制番茄侧芽中BRC1的表达来促进侧芽的生长。 为了评估 BRC1 在 HY5 调节的芽生长中的作用，我们沉默了HY5 -RNAi 和 WT 植物中的BRC1（图 S6 A）。在 WL 下， BRC1沉默的植物的芽长出显着增加（图 S6 B - D）。我们接下来生成了brc1和brc1hy5突变体（图 S7 A）。与hy5突变体形成鲜明对比的是，brc1突变体（brc1 #5、brc1 #9）的侧枝数量和总长度增加（图 2） E和F 以及 图 S7 B – D）。至关重要的是，双brc1hy5突变挽救了hy5突变体中的芽长出表型。brc1hy5突变体的侧芽数量和总长度与brc1突变体相似（图2 E和F 以及 SI 附录，图 S7 E）。这一遗传证据支持BRC1作用于 HY5 下游以调节番茄芽生长的假设。 为进一步验证 HY5 和 BRC1 在分枝光调控中发挥重要作用，将八叶期的WT、 hy5和brc1 #5 植株在黑暗中预驯化 12 h，然后置于不同 R/FR 条件下光处理。R/FR 光比的降低导致 WT 植物中侧枝的数量和总长度显着减少。然而，R/FR 光比的变化对hy5或brc1突变体中侧芽的数量和总长度几乎没有影响（图 2 G和H 和图 S8）。此外，HY5的突变废除了 R/FR 光比诱导的BRC1转录物水平变化（图 S8）。此外，编码 BR 生物合成蛋白DET2和DWF的转录物水平和 BL 积累水平在HY5 -RNAi 芽中降低，但在HY5 -OE 植物中升高（图 2 I和J）。这些观察结果支持 HY5 通过在 BRC1 和 BR 的上游发挥作用来促进番茄芽生长的光控这一概念。
3.3 HY5 作为转录因子调节番茄中的BRC1、DET2和DWF转录本。 我们接下来检查了 HY5 是否通过BRC1和 BR 生物合成相关基因的转录调节在光信号下游发挥作用。搜索番茄BRC1、DET2和DWF基因的启动子揭示了几个 HY5 结合基序，例如这些中的 G-BOX (CACGTG)、A-BOX (TACGTA)、Z-BOX TACGTG 和 C-BOX (GTCANN) 基序基因（图 S9 A – C）。 电泳迁移率变动分析 (EMSAs) 证实 HY5 可以结合包含 A-box、G-box 和 C-box 元件的BRC1、DET2和DWF DNA 探针（图 3 A 和图 S9 D）). 然而，HY5 未能与突变探针结合，证明了 HY5 与这些启动子结合的特异性。此外，ChIP-qPCR 分析提供了 HY5 与BRC1、DET2和DWF启动子结合的进一步证据（图 3 B）。 此外，双荧光素酶测定显示 HY5 反式抑制BRC1的启动子，但反式激活DET2和DWF的启动子（图 3 C 和 图 S9 E）。总的来说，这些发现表明 HY5 抑制BRC1表达并促进DET2和DWF基因通过与其启动子结合。总之，这些结果表明 HY5 直接参与了番茄中BRC1转录和 BR 合成的调节。
3.4 BRC1 调节番茄侧芽中的 CK 和 GA 代谢。 为了识别BRC1的下游目标和相关的调控网络，对 WT、 brc1 #5 和brc1 #9 植物第 4 个茎节的侧芽进行了 RNA-Seq 分析，这些植物在 WL 下的八叶期 11是。使用 <0.05 的错误发现率 (FDR) 和 >1 的倍数变化作为显着性截止值，与 WT 相比，在brc1 #5 和brc1 # 9 的两个品系中鉴定出 3,958 个差异表达基因 (DEG)。在这些 DEG 中，与 WT 植物相比，brc1 #5 和brc1 #9 突变体的芽中有 2,301 个转录物显着增加，1,655 个转录物减少（ 图 S10 A 和数据集 S1）。编码参与 CK 和 GA 生物合成和分解代谢的蛋白质的基因子集得到富集，而编码参与生长素和 ABA 信号转导的蛋白质的其他基因没有显着变化（数据集S2）。热图分析表明，CK 合成基因LOG4、CK 降解基因CKX7以及 GA 降解基因GA2ox4和GA2ox5在 WT、brc1 #5 和brc1 #9 植物中差异表达（图 S10 B和C）。 qRT-PCR 证实了LOG4转录本增加了 147% 到 266%，而CKX7的转录本在两个brc1突变体中相对于 WT 植物减少了 88% 到 90%（图 4A ）。同时，与 WT 植物相比，brc1 #5 和brc1 #9 植物的侧芽中GA2ox4和GA2ox5转录本的水平显着降低。UPLC/MS/MS 分析显示，与 WT 相比，b rc1 #5 和brc1 #9 植物的侧芽中的总 CK（iP、iPR、tZ 和 tZR、DHZ 和 DHZR）水平显着增加（图. 4B)。至关重要的是， brc1 #5 和brc1 #9 芽中生物活性 CK tZ 以及 DHZR、tZR、iPR 和 DHZ 的水平显着高于WT。 此外，活性 GAs GA1、GA3、GA4 及其前体 GA8、GA19 和 GA20 的水平在 brc1 # 5 和brc1 #9 芽中显着高于 WT，增幅在 33% 和126%（图 4C ）。然而， brc1 #5 和brc1 #9突变体侧芽中的吲哚-3-乙酸 (IAA) 水平仅略低于野生型或没有显着差异（图 S11 A）)。WT 和brc1 #5 或brc1 #9 植物之间的侧芽 ABA 水平也没有显着差异（图 S11 B）。同时，WT 和 ABA 合成突变体not的侧枝数量和总长度没有观察到显着差异（图 S11 C - E）。综上所述，这些观察结果表明，CK 和 GA 的积累增加可能导致番茄中brc1突变体的横向生长增加。
3.5 BRC1在体外和体内直接与LOG4、CKX7、GA2ox4和GA2ox5启动子结合。 为了进一步剖析 BRC1 在 CK 和 GA 信号通路中的调节作用，分析了LOG4、CKX7、GA2ox4和GA2ox5基因的基因组序列中的顺式作用元件。鉴定了LOG4、GA2ox4、GA2ox5和CKX7启动子中的几个推定元件（图 S12 A）。EMSA 显示 BRC1 与LOG4 -A（TGGGCC 基序）、CKX7 -A（GGGCCCAA 基序）、GA2ox4-B（GGGACCAT 基序）和GA2ox5-A 的DNA 探针结合（GGTGCCCT 基序）。 此外，该结合被未标记的 DNA 探针成功地击败，但未被未标记的突变探针击败，其中 TGGGCC、GGGCCCAA、GGGACCAT、GGTGCCCT 基序分别被 TAAAAA、AAACAAAA、AAAAAAAT、AATGAACT 基序取代。此外，BRC1 无法与突变探针结合，证明 BRC1 与LOG4、CKX7、GA2ox4和GA2ox5启动子结合的特异性（图 4D ）。 酵母单杂交试验表明，含有P LOG4 −、P ckx7 −、P GA2ox4 − 和P GA2ox5的酵母细胞− 诱饵载体和 BRC1-AD 载体能够在含有金黄担子素 A (AbA) 的 SD/Leu-media 上生长。相反，没有 BRC1 的转化体不能在该培养基上生长（图 4 E）。双荧光素酶测定显示LOG4启动子的活性被 BRC1 结合抑制，而CKX7、GA2ox4和GA2ox5启动子的活性被 BRC1 结合激活（图 4 F 和 图 S12 B）。总之，这些体外和体内实验表明 BRC1 抑制LOG4的表达但激活CKX7的表达、GA2ox4和GA2ox5通过直接结合它们在番茄中的启动子。 3.6 LOG4、CKX7、GA2ox4和GA2ox5的局部转录调控是番茄芽生长所必需的。 基于上述结果，可以合理地推测BRC1介导的分支发育抑制依赖于其在LOG4、CKX7、GA2ox4和GA2ox5表达调节中的作用。为了检验这一假设，我们在 WT 植物中表达了LOG4、CKX7、GA2ox4和GA2ox5 ，这些基因受BRC1启动子 (pBRC)的控制。获得了两个代表性的 pBRC1–LOG4 和 pBRC1–CKX7 转基因系。不幸的是，pBRC1– GA2ox4的愈伤组织和 pBRC1– GA2ox5转化未能生长，可能是因为 GA 的积累减少。pBRC1–LOG4 系中 LOG4 蛋白的特异性积累显着促进了芽的生长（图 4 G 和 图 S14 A和B）。相反，CKX7 蛋白在 pBRC1–CKX7 系中的特异性积累显着降低了侧枝的数量和总长度。我们还分别使LOG4和CKX7沉默，并使用 VIGS 使GA2ox4和GA2ox5基因共沉默。所得品系的这些转录物水平降低了 68% 至 85%（图 S14 C）。与上述结果一致，我们发现LOG4的沉默导致侧枝的数量和总长度减少。相比之下， CKX7的沉默或GA2ox4和GA2ox5的共沉默导致侧芽的数量和总长度与相应的空载体 (EV) 烟草脆裂病毒 (pTRV) 质粒对照相比增加（图 4 H和图 S14 D和E）。总之，这些结果表明 BRC1 通过转录调控影响 CK 和 GA 信号通路LOG4、CKX7、GA2ox4和GA2ox5基因，从而抑制番茄芽的生长。 3.7 BRC1 转录物积累的时空调控与番茄芽生长的昼夜变化有关。 为了进一步了解控制光调节芽生长的机制，我们检测了BRC1转录物水平的昼夜变化、HY5 和 BZR1 蛋白的积累以及芽生长速率。侧芽白天的BRC1转录物水平低于夜间（图 5A ）。与茎伸长相反，侧芽在白天比夜间具有更高的相对生长率（图 5 B）。qRT-PCR 分析表明，hy5突变体的BRC1转录本白天水平高于bzr1突变体和 WT，而 WT 植物的BRC1水平最低白天的成绩单。WT、hy5突变体和bzr1突变体在夜间都具有更高水平的BRC1 。WT 植物在夜间具有最低水平的BRC1转录物，但在白天或夜间在hy5突变体中观察到BRC1转录物的积累没有显着差异（图 5C ）。Western blotting 和 qRT-PCR 分析显示侧芽在白天比晚上积累更多的 HY5 蛋白和更高水平的HY5转录物（图 5 D 和 图 S15 A)。然而，在白天或夜间采样的侧芽中，没有观察到 BZR1 蛋白积累或BZR1转录物水平的实质性差异（图 5 E 和 图 S15 B）。同时，芽在白天比晚上积累了更多的蔗糖，即番茄韧皮部中的运输糖。与 WT 植物相比，这种对蔗糖积累的昼夜影响在HY5 -OE 植物中最大，在HY5 -RNAi 植物中最不明显（ 图 S16 A）). 叶面施用蔗糖显着促进了芽的生长并增加了 HY5 和 dBZR1 蛋白的积累，但降低了芽中的BRC1转录物水平（图 5 F 和 图 S16 B - E）。总之，这些数据表明 HY5 有助于番茄中BRC1转录物积累和芽生长速率的昼夜变化。 为了确定叶子中的 HY5 库对调节芽长出的贡献，我们将hy5植物（有四片真叶）的枝条嫁接到有四片叶子的HY5 -OE 植物上（ hy5/HY5 -OE），分别转化为表达 C 端与血凝素 (HA) 标签融合的 HY5，或具有四片叶子的hy5植物 ( hy5/hy5 )。HY5–HA 标签融合蛋白在hy5/ HY5 -OE 接枝的接穗侧芽 ( hy5 )中可检测到，但在hy5/hy5 接枝的接穗侧芽 (hy5)中检测不到（图 5G ）。此外，HY5水平升高在hy5/HY5 -OE 品系的hy5接穗侧芽中检测到转录本（图 S17 A）。至关重要的是，在hy5 /HY5 -OE 移植物中， hy5接穗的侧枝数量和总长度显着增加。相对于自嫁接的hy5/hy5组合，这与BRC1转录本的积累减少有关（图 5 H和I 和图 S17 B和C). 为了支持来自叶子的 HY5 在芽长出中的作用，用锡箔遮蔽侧芽并没有明显改变遮蔽芽中的 HY5 积累和BRC1转录物，并且对芽长出几乎没有影响（图 5 G – I 和 图 S17 D和E）。相比之下，遮荫植物中的芽比遮荫植物中的芽和光照植物中的芽表现出更高的BRC1转录和低的 HY5 积累。这些结果共同表明，HY5 作为一种系统信号，可以在番茄侧芽生长的调节中从叶子移动到侧芽。
 04 结论 1 光通过番茄中 BR 依赖和独立途径调节芽的生长。 2 HY5 通过作为转录因子调节番茄中BRC1、DET2和DWF的表达，对于释放顶端优势至关重要。 3 BRC1 通过抑制番茄中 CK 和 GA 的积累来抑制芽的生长。 4 HY5 的时间和空间流动特性有助于番茄芽生长的昼夜调节。 控制光调节分支的信号通路难以捉摸。在这里，我们提供了令人信服的证据支持 HY5 通过在番茄中通过直接作用和 BZR1 介导的间接作用抑制BRC1转录来控制枝条分枝的概念。 此显示的结果表明，BRC1 通过 LOG4 、 CKX7 、 GA2ox4和GA2ox5的转录调节减少 CK 和 GA 积累，从而抑制芽长出基因。至关重要的是，我们提供的证据表明，叶子中产生的 HY5 的光激活运动调节芽的生长，而 HY5 作为一种移动的系统信号，有助于番茄芽生长的昼夜调节。基于这些发现，我们提出了一个模型，其中 HY5 整合光信号和 BRC1 功能以调节番茄芽的生长（图 5 J）。 05 原文获取 原文链接： https:///10.1073/pnas.2301879120 原文获取： https://www./h-nd-187.html |
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