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单位：浙江大学医学院附属第一医院呼吸与危重症医学科引用本文：周华. 下呼吸道感染宏基因组二代测序报告解读需要注意的几个问题 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2023, 46(4) : 319-321. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20221117-00903. 【摘要】宏基因组二代测序技术（mNGS）是下呼吸道感染病原诊断的重要方法。mNGS报告的解读需要参考标本类型、测序参数，详细结合患者具体情况，收集多种微生物学检测结果，根据治疗效果和疾病转归，进行仔细甄别和判断，并最终做出诊断。mNGS报告的解读也需要我们储备更多的微生物学、测序和生物信息学分析知识，需要我们更加注重团队的力量、在多学科协作诊疗中辨析真相。 下呼吸道感染诊治的关键是病原学诊断，但传统病原学检测方法并不能完全满足临床需求，宏基因组二代测序技术（mNGS）作为新兴的病原检测方法是重要的补充手段。呼吸道具有丰富多样的微生物组、肺部疾病疑难复杂，对可疑下呼吸道感染患者的mNGS报告解读有诸多难点，且尚无规范化的路径和流程。结合中华医学会呼吸病学分会完成的《下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识》[1]内容，在下呼吸道标本mNGS报告解读过程中如下几个问题需要特别注意。 及时获取合格的下呼吸道标本是得到一份有效mNGS报告的前提。对mNGS报告的解读不能只局限在字面报告的分析，需要从标本获取阶段了解整个过程。呼吸道与外界相通，非无菌腔隙，标本获取过程必然受到呼吸道微生物组污染，标本类型、获取方式都直接影响结果解读。无论在何种呼吸道标本中检出致病微生物均需要高度重视；肺泡灌洗液、防污染毛刷等直接来源于下呼吸道的标本中检出条件微生物意义明显高于痰液标本；痰液标本中检出呼吸道定植微生物则通常不能作为病原诊断的重要依据。与培养相比，抗菌药物使用对mNGS病原检出的影响较小，但其检测效率同样受到标本中病原体含量的影响。在疾病早期阶段，采集来自感染部位的标本将更大程度保障检测敏感性。使用抗感染治疗后采集的标本的阴性检测结果作为排除感染的证据面临风险，因为存在假阴性可能[2]。正确的mNGS报告解读需要建立在对患者及其病情充分理解的基础上。任何一个病原检测方法得到的结果，都需要结合患者、结合病情。这里面包括两个层面，第一是患者，即什么人生病了；第二是病情，病情严重程度、疾病所处的阶段。患者的情况包括基础疾病、免疫状态、获得感染的流行环境、抗菌药物暴露情况，甚至包括患者职业和生活环境。在基础疾病繁多、免疫功能低下患者检出条件病原体需要充分重视，如mNGS在免疫缺陷患者中检出耶氏肺孢子菌时感染可能性大，免疫健全患者中则定植可能大[2]。职业或生活环境接触与下呼吸道感染病原体也高度相关，如皮炎芽生菌感染与北美旅居史相关[3]、鹦鹉热衣原体肺炎患者常有禽类接触史。重症肺炎患者，尤其是出现多脏器功能不全情况下，针对mNGS检测到的病原体，如无充分证据排除感染，可适用降阶梯治疗原则选择合适抗菌药物进行覆盖，同时寻求其他微生物学证据支持；对于病情稳定的患者，对没有充分证据证明为感染的病原体，可在寻找其他微生物学证据后再启动治疗。患者疾病所处的阶段同样是mNGS检测结果判断中的重要参考因素。例如，在耐药菌流行病区患者呼吸道样本中检出相应的耐药细菌，对住院时间短、无前期抗菌药物暴露的患者常可判断为定植；而对于反复抗菌药物使用、住院时间长、高危因素多的患者则感染风险增加。是否根据mNGS报告中的主要参数分析了报告的质量？ 理解mNGS报告包含的主要参数定义及其意义。根据主要参数指标分析报告质量，判断结果可信程度。结合检出微生物的种类、特异性序列数、基因组覆盖度及相对丰度判断其为致病菌、定植菌还是背景菌[4]。需要重点关注序列数高、相对丰度高的微生物。例如，mNGS检测到耶氏肺孢子菌时，当序列占明显优势和/或序列数高时常提示感染可能大，当序列数和占比均很低时则定植可能较大。也需要关注微生物序列与人源核酸序列的比值，人源核酸序列占比越高的标本越需要注意病原检测的假阴性可能。mNGS耐药性检测结果难以解释，尤其是标本来自正常情况下有微生物定植或污染的部位[4]，因此建议慎重解读和采纳呼吸道标本mNGS报告中可能包含的病原体耐药相关信息。了解基本的微生物学知识有利于识别mNGS报告中有价值的病原体。对常见病原体应有基本的了解，包括常见感染的部位、常见定植的部位、常见分布的自然环境等。任何一种病原体引起感染都有相应的特点和规律。将病原体的特点与患者的特点结合起来，将能够更加准确地分析mNGS的报告，得到更符合临床实际的结果。遇到不熟悉的微生物，可借助病原检索工具https：//www.chinapneumonia.cn/pathogens查询其在既往感染性病例中的报道。mNGS作为高度敏感的病原学检测手段，目前仍非病原感染的确诊标准，并不能取代基于培养、涂片、抗原、抗体或PCR等病原诊断方法，例如mNGS检测到肺孢子菌时，1，3-β-D葡聚糖检测在鉴别定植或感染上具有重要的参考价值[5]。对于部分病原体检测，mNGS优势不明显，也需要其他微生物检测手段的补充，例如mNGS在隐球菌检测上存在一定假阴性[6]，而隐球菌荚膜多糖抗原在诊断隐球菌感染中敏感度和特异度俱佳。若单一标本无法判定是否致病微生物，有条件情况下可结合多个不同类型标本的检测结果判断。病原学结果通过mNGS和其他微生物检测结果相互支持，将更加夯实诊断，为后续治疗坚定信心。依靠团队的力量，积极组织多学科讨论。下呼吸道感染mNGS报告的正确解读常涉及呼吸与危重医学、感染性疾病、临床微生物、病理、临床药学、医院感染管理、分子实验室等学科与部门。对于解读存在困难或者意见分歧的病例，应当积极开展多学科讨论，集思广益，得到最优的诊疗方案。根据临床治疗反应和疾病演变不断调整诊疗策略。基于mNGS结果、结合临床情况、进行充分分析得到的诊断仍然不是最终诊断。需要根据疾病的演变发展、患者对治疗的反应，对病情和结果进行再分析，必要时多次进行病原学检测、动态调整治疗策略，最终取得更加明确的诊断和更加良好的治疗效果。 总之，mNGS报告的解读需要参考标本类型、测序参数，详细结合患者具体情况，收集多种微生物学检测结果，根据治疗效果和疾病转归，进行仔细甄别和判断，并最终做出诊断。mNGS报告的解读也需要我们储备更多的微生物学、测序和生物信息学分析知识，需要我们更加注重团队的力量、在多学科协作诊疗中辨析真相。
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