单细胞免疫组库可以额外做啥? scTCR可以更细致的获取肿瘤免疫微环境的变化,比如单细胞转录组可以获取不同样本,不同分组(癌和癌旁,是否治疗,是否响应)的celltype组成,可以知道哪些celltype发生变化。 而TCR可以进一步的得知发生变化的celltype中clone扩展情况如何,治疗响应组中clone是变多了还是变少了?不同celltype之间是否共享一些clone?是否出现了noval的clone?clone最多的TCR序列是哪些?这些序列和哪些peptide结合最强?是否可以用于CAR-T或者TAR-T治疗等等。 本系列会使用2021年Cancer Cell文章“Single-cell sequencing links multiregional immune landscapes and tissue-resident T cells in ccRCC to tumor topology and therapy efficacy”中的部分样本作为示例展示TCR的常见应用场景以及可视化。 该数据集的多个样本都有多处采样位置,多数样本同时含有RNA和TCR数据,且含有治疗前后的数据,ICB响应与否的数据,非常适合免疫组库系列分析的练习。 一 数据集下载 Pubmed中找到该文章,然后在Data Availability Statement 中发现文章的原始数据在PRJNA705464,下载原始的sra文件来开启 “从0开始scVDJ”的系列分析。 1,数据集下载在浏览器输入https://www.ncbi.nlm./Traces/study/,在Accession 中输入BioProject的ID号(PRJNA705464), 下拉找到以下信息,就可以开始下载了,介绍以下两种下载方式 (1)可以点击具体的Run,然后找到Data Access ,获取下载链接后进行下载。 (2)也可以获取第一列的SRR信息,使用SRAToolkit的prefetch进行批量下载 1.1 安装SRAToolkit可以在https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit的链接中选择合适的SRAToolkit下载 或者通过wget方式获取
1.2 prefetch下载数据 (1)单个Run下载prefetch 后面添加上SRR的ID号即可 ,prefetch建议使用绝对路径 , 可以添加--max-size 100G 参数。
(2)SRR_ACC_List 批量下载(一列SRR编号的文件)
(3)shell循环下载
软件建议使用绝对路径。2 sra文件转为fastq使用sratoolkit中的fastq-dump命令将 sra 转化为 fastq 文件。 进入到sra数据的存储文件夹中,可以用下述代码进行批量的格式转化:
注:--split-3 filename其中--split-3参数代表着如果是单端测序就生成一个 .fastq文件,如果是双端测序就生成_1.fastq 和*_2.fastq 文件。 3 修改cellranger 输入格式得到fastq文件后,还需要转为cellrange 分析需要的格式(比如,将得到的SRR_1.fastq.gz改为SRR_S1_L001_I1_001.fastq.gz)。 可以使用上述方式进行批量修改,但是要注意生成文件的个数,如果像本示例中产生的是R1和R2文件,那就将原来_1的改成R1,将_2改成R2。
注:样本名称不要有下划线"_",可以是短线"-"。 二 cellranger分析 首先进行cellranger的下载和安装,参照10X官网https://support./single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_in 或者 单细胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 开启单细胞之旅(上) 1 scRNA分析首先下载refdata文件,然后解压
进行cellranger count分析
运行结果在outs文件夹,建议每个文件都在官网中查一下大概的含义,这里重点关注outs/filtered_feature_bc_matrix文件夹, 单细胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 开启单细胞之旅(上) 2 scVDJ分析首先下载V(D)J reference文件,然后解压
进行cellranger vdj分析
运行结果在outs文件夹,文件很多,建议根据https://support./single-cell-vdj/software/pipelines/latest/output/overview了解以下每个文件的意义。outs/filtered_contig_annotations.csv文件,更需要重点了解每一列的意义。 以上,得到每个样本的单细胞RNA和TCR的结果后就可以使用scRepertoire 或者STARTRAC 进行免疫组库以及T细胞动态等分析了。 这些分析后续会进行系统的介绍。 参考资料:Single Cell Immune Profiling - Official 10x Genomics Support ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ 精心整理(含图PLUS版)|R语言生信分析,可视化(R统计,ggplot2绘图,生信图形可视化汇总) |
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