LncRNA-BC069792靶向KCNQ4抑制乳腺癌肿瘤进展

外科黄文斌 2023-04-25 发布于广东

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在本研究中，作者为探索lncRNA BC069792在乳腺癌中的角色，建立了小鼠模型，开展高通量测序、WB、免疫组化、拯救和突变等实验。结果发现LncRNA BC069792在乳腺癌组织中低水平表达，在乳腺癌病理分级高、淋巴结转移和Ki-67指数高的组中表达均显著下调。而且BC069792抑制体内外乳腺癌细胞增殖、侵袭和代谢。机制上，BC069792作为分子海绵，吸引hsa-miR-658和hsa-miR-4739，上调Potassium Voltage-Gated Channel Q4（KCNQ4）的表达，抑制JAK2和p-AKT活性，在抑制乳腺癌生长中扮演着重要作用。LncRNA BC069792担任乳腺癌中的肿瘤抑制因子，是乳腺癌的一种新的诊断指标和治疗靶点。本研究于2023年3月发表于期刊《Molecular cancer》上，IF：36.3。

技术路线：

主要研究结果：

1、BC069782在乳腺癌组织中的表达

研究采集98例乳腺癌样本，其类型均为原发性浸润癌和非特征性乳腺癌。作者首先采用RT-qPCR检测BC069792在98对乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达。结果显示BC069792在乳腺癌组织中的表达水平显著低于在正常癌组织中的水平，表达量差异约为4.87倍（图1a）。ROC曲线分析结果显示，BC069792的表达能够区分乳腺癌组织与正常乳腺组织，曲线下面积为0.9191（图1b）。这提示BC069792可作为乳腺癌的分子标志物。

2、BC069792的定位和稳定性

以GAPDH作为细胞质内参，U6为细胞核内参的RT-qPCR检测结果显示，MDA-MB-231细胞系中BC069792约27.6%位于细胞质中。在MDA-MB-468细胞系中，约26.4%的BC069792在细胞质中表达，73.6%的BC069792在细胞核中表达，说明BC069792在细胞核和细胞质中都有作用（图1c）。此外，RNA-FISH实验也显示BC069792分布在细胞核和细胞质中（图1d）。

为检测BC069792的稳定性，作者在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中进行放线菌素D给药实验。RT-qPCR发现给药后0 h, 0.5 h, 1 h, 4 h, 8 h和12 h检测到细胞中BC069792的内容。这表明，与C-MYC相比，BC069792在MDAMB-231和MDA-MB-468细胞中可较长时间稳定存在（图1e）。

图1 BC069792在乳腺癌组织中的表达

3、BC069792在体外抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力

BC069792与临床病理参数的关系提示BC069792在乳腺癌中发挥抑癌基因的作用。为阐明BC069792在乳腺癌中的特异功能，作者在体外进行一系列实验。CCK-8和EdU实验表明，与对照组相比，过表达BC069792能显著抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的增殖（图2a-b）。Transwell实验结果显示，与对照组相比，BC069792过表达细胞穿过基底膜的数量显著减少（图2c），这说明BC069792过表达显著抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468的迁移和侵袭能力。

图2 BC069792抑制乳腺癌细胞增殖能力

4、BC069792抑制体内乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力

作者通过皮下注射慢病毒LV-BC069792和LV-NC感染MDAMB-231细胞，建立裸鼠皮下肿瘤模型。5周后，LV-BC069792组的6只裸鼠中有5只检测到肿瘤，LV-NC组中6只裸鼠全部发现肿瘤（图3a）。肿瘤生长曲线显示，LV-NC组的肿瘤生长速度明显高于LV-BC069792组（图3b），且LV-BC069792组小鼠的肿瘤大小明显小于LV-NC组（图3c）。从裸鼠肿瘤组织中提取RNA，进行RT-qPCR实验，证实BC069792在LV-BC069792组的表达水平明显高于LV-NC组（图3d）。LV-BC069792组Ki-67指数明显低于LV-NC组（图3e）。上述结果表明，BC069792过表达可抑制乳腺癌细胞增殖。

将慢病毒感染的MDA-MB-231细胞通过尾静脉注射到裸鼠体内，建立远端转移模型。结果显示，LV-BC069792组有3只裸鼠发生肺部转移。裸鼠肺中位转移瘤数为2个，且体积较小。LV - NC组有6只裸鼠出现肺部转移灶，裸鼠肺部转移灶中位数为13个，肿瘤体积较大。RT - PCR结果显示，与LV - NC组相比，LV - BC069792组中BC069792的表达明显升高（图3f）。LV - NC组可见肿瘤进攻肺脏，其中1只裸鼠肝脏粘连于膈肌，膈肌内可见乳腺癌转移灶。LV - BC069792组除肺外未发现其他转移灶。皮下移植瘤模型中，LV - NC组肿瘤浸润脂肪、横纹肌和skin appendages，而LV - BC069792组肿瘤边界更清晰，形成假包膜，无明显侵袭（图3i）。裸鼠皮下成瘤和远处转移模型证实BC069792能有效抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

图3 BC069792抑制体内乳腺癌细胞增殖和侵袭。

5、RNA-Seq分析揭示KCNQ4是BC069792重要的下游靶基因

根据mRNA表达水平，测序结果中log2差异倍数大于2倍且p< 0.05，从测序结果中筛选出30个基因进行验证。RT-qPCR结果显示，在30个基因中，KCNQ4在BC069792过表达组与对照组的表达差异最大，在MDA-MB-231细胞中表达量最高（图4a）。过表达BC069792后，KCNQ4蛋白的表达量也增加（图4b）。KCNQ4在正常乳腺组织中的mRNA和蛋白表达明显高于乳腺癌组织（图4c-d）。腋窝肿瘤和肺转移，KCNQ4蛋白和mRNA的表达，LV-BC069792组显著高于对照组LV-NC组（图4e-h）。BC069792的表达与KCNQ4呈正相关（图4i-j）。BC069792可以促进KCNQ4 RNA稳定性（图4k）。上述结果表明，BC069792在乳腺癌中调控KCNQ4 mRNA和蛋白的表达，提示BC069792可能通过促进KCNQ4的表达来抑制乳腺癌的进展。

图4 KCNQ4是BC069792的下游靶基因。

6、BC069792作为内源性竞争RNA（ceRNA），通过吸附miR-658和miR-4739上调靶基因KCNQ4的表达

作者用IgG作为对照进行RIP实验。结果显示，内源性BC069792和KCNQ4-3'UTR被Ago2抗体特异性富集（图5a），提示BC069792和KCNQ4可以与细胞质中的特异性miRNA结合。作者通过miRWalk、RegRNA2.0等网站和ENCORI数据库预测能够与BC069792和KCNQ4结合的靶miRNA，TCGA数据库筛选出乳腺癌和正常乳腺组织中差异表达的miRNA。在3组交集中发现3个促癌miRNA，分别是miR-658、miR-632和miR-4739（图5b）。将mirGLOBC069792 / pmirGLO– NCmimics或mimics NC与3种miRNAs共转染至MDA - MB - 231和MDA - MB - 468细胞株，48 h后用酶标仪检测细胞中荧光素的含量。与对照组相比，miR - 658和miR - 4739显著抑制pmirGLO - BC069792荧光素酶的活性（图5c），而miR - 632无明显作用。最后，将miR - 658和miR - 4739的mimics与pmir GLO-KCNQ4 3 ' UTR质粒共转染MDA - MB - 231和MDA - MB - 468细胞，48 h后用酶标仪检测细胞内荧光。miR - 658和miR - 4739均能降低pmir GLO-KCNQ4 3 ' UTR双荧光素酶活性（图5d）。为证明miR-658或miR-4739与BC069792和KCNQ4特异性结合，作者在突变结合位点后再次进行上述实验。结果显示，miR-658和miR-4739在结合位点突变后，不再能够降低pmirGLO-BC069792和pmirGLO-KCNQ4 3’UTR的荧光素酶活性（图5e-f）。在小鼠腋窝肿瘤和肺转移中，LV-BC069792组miR-658和miR-4739的表达低于LV-NC组（图5g-j）。上述结果表明miR-658和miR-4739能够特异性结合BC069792和KCNQ4的3'UTR。当BC069792和KCNQ4 3'UTR突变删除了miR-658和miR-4739结合位点时，它们则不能与miR-658和miR-4739结合。上述结果表明，BC069792像海绵一样吸附miR-658和miR-4739，解除其对靶基因KCNQ4的抑制，从而上调KCNQ4的表达。

图5 BC069792通过结合miR-658和miR-4739上调KCNQ4

7、BC069792上调KCNQ4，从而抑制JAK2和AKT磷酸化，抑制乳腺癌进展

根据作者的RNA - Seq数据，胆碱能突触上的BC069792（hsa04725）增加KCNQ4、PIK3R3和AKT的表达。众所周知，PI3K / AKT是经典的肿瘤信号转导通路，在肿瘤的增殖、侵袭和转移中起着至关重要的作用。KCNQ4的mRNA表达与BC069792呈正相关，与JAK2呈负相关；BC069792的蛋白表达与KCNQ4呈正相关，与JAK2呈负相关（图6a-b）。在MDA - MB - 231细胞系中，过表达BC069792显著降低p - AKT的表达（图6c）。同组样本中KCNQ4的蛋白表达量明显高于p - AKT（图6d）。结合BC069792过表达组和对照组中KCNQ4和p – AKT WB检测结果，进行spearman相关性检验，发现KCNQ4与p - AKT呈负相关（图6e）。与LV - NC组相比，LV - BC069792组p - AKT表达明显降低（图6f）。上述结果表明BC069792通过上调KCNQ4抑制JAK2蛋白的表达和AKT蛋白的磷酸化，降低p-AKT的表达，进而抑制乳腺癌的进展。

为进一步验证BC069792是否通过竞争吸附hsamiR-658和hsa-miR-4739发挥生物学功能，作者进行拯救实验。结果显示，过表达BC069792的乳腺癌细胞增殖能力降低，迁移能力减弱，KCNQ4蛋白表达水平升高。当BC069792与hsa - miR - 658或hsa - miR - 4739同时过表达时，BC069792对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用被逆转（图7a-b），升高的KCNQ4蛋白表达水平降低（图7c），降低的p - AKT蛋白水平升高（图7d）。Spearman相关性检验显示KCNQ4与p-AKT的负相关性恢复（图7e）。上述结果表明，BC069792通过与miRNA结合发挥其生物学功能，可作为分子海绵吸附hsa-miR-658或hsa-miR-4739，上调靶基因KCNQ4蛋白表达，抑制p-AKT活性，进而发挥抑制乳腺癌的作用。

图6 KCNQ4调控的下游效应分子为JAK2/p-AKT。

图7挽救实验

结论

LncRNA BC069792在乳腺癌中表达较低，在高组织学分级、淋巴结转移及Ki-67指数组中表达明显降低。BC069792通过BC069792-hsa- miR -658/ miR-4739-KCNQ-JAK2-AKT的ceRNA调控网络，抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，并抑制体内、体外乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。

作者首次发现lncRNA可以靶向钾通道蛋白诱导AKT磷酸化。在此基础上，研究钾通道KCNQ4的作用机制及其在癌症中的作用。

图8 LncRNA BC069792抑制乳腺癌肿瘤进展的机制

参考文献

Zhang Y, Dong X, Guo X, Li C, Fan Y, Liu P, Yuan D, Ma X, Wang J, Zheng J, Li H, Gao P （2023）LncRNA-BC069792 suppresses tumor progression by targeting KCNQ4 in breast cancer. Mol Cancer;22（1）:41. doi: 10.1186/s12943-023-01747-5. PMID: 36859185; PMCID: PMC9976483.