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大家好，今天给大家带来Cell Metabolism上的一篇文献，题目是“TGR5 Activation Inhibits Atherosclerosis by Reducing Macrophage Inflammation and Lipid Loading”
背景介绍 TGR5是一种胆汁酸的细胞表面GPCR受体，并且TGR5在免疫细胞中高表达。TGR5信号通路的激活控制着一些与代谢稳态相关的生理途径，例如，在肝脏中，TGR5的激活可以防止肝细胞脂肪变性的发展，也有报道发现TGR5的激活可以抑制肝脏炎症的进展。 动脉粥样硬化（AS）是一种慢性血管壁疾病。血脂异常和慢性炎症促进了动脉粥样硬化的发生发展，其中巨噬细胞被认为发挥了重要作用。巨噬细胞为清除血管壁中修饰的低密度脂蛋白，最终导致泡沫细胞形成。同时，局部产生细胞因子和趋化因子，引发血管壁的慢性炎症，这是动脉粥样硬化发病机制之一。 文章的假设 TGR5-cAMP信号被TGR5激动剂INT-777激活后引起NF-κB信号通路的抑制,使得一些引起炎症的趋化因子与细胞因子产生减少，减缓AS疾病进展，而INT-777对血管病变的抑制作用主要是由白细胞所介导的。 文章结果 1、TGR5激动剂INT-777抑制巨噬细胞炎症 文章首先探讨了TGR5与体内免疫调节之间的作用。在Tgr5-/-与Tgr5 / 动物注射LPS，作者发现TGR5 / 血清TNFα水平更低，或许提示TGR5对机体炎症有抑制作用。
然后作者探讨的是TGR5在各个炎症细胞群和不同组织之间的表达情况。在对C57BL/6J小鼠腹腔注射巯基乙酸以诱导并提取免疫细胞，进行FACS分选（B-cells (B220 ), T-cells (TCR ), granulocytes (Cd11b Gr )， macrophages (Cd11b Gr-)），以及分离提取不同的组织。对各免疫细胞群以及组织的Tgr5 mRNA分析可知，Tgr5在胆囊中高度富集，Tgr5在已分化的CD11b Gr-巨噬细胞群体中高表达。
如同上述，作者又针对Tgr5-/-与Tgr5 / 小鼠同样采用注射巯基乙酸与FACS分选，富集得到巨噬细胞 (Cd11b Gr-），并使用INT-177去处理提取得到的巨噬细胞（INT-777是一种半合成的胆汁酸类似物，6α-乙基-23(S)-甲基胆酸（6-EMCA），是TGR5的激动剂），测量钙通量和细胞内cAMP水平（TGR5是一个GPCR, 这被认为是一种观察TGR5被激活的标志，所以这也间接表明了INT-177对TGR5的激动作用），结果发现，Tgr5-/-的巨噬细胞不受INT-177影响。
那么，是否表达TGR5会使巨噬细胞对LPS响应有影响吗？提取了两种动物的巨噬细胞给予LPS刺激，检测TNFα水平及其mRNA水平，结果发现含TGR5的巨噬细胞对LPS的响应降低。
过表达TGR5与WT的这个对比也能反映这个现象。
当使用INT-777与LPS共同处理时会发现，INT-177可以降低一系列的趋化因子与细胞因子的转录水平。
2、TGR5通过cAMP信号抑制NF-κB的激活 上面发现了TGR5的激活可以抑制巨噬细胞炎症因子的产生，那么这背后的具体机制是怎样的呢？作者将目光转至两种促炎转录因子通路上来——c-Jun,和NF-κB。当对RAW264.7巨噬细胞给予INT-777与LPS共处理后，WB检测c-Jun与c-Jun磷酸化水平（表示c-Jun被激活标志）；NF-κB与细胞核内p65水平（NF-κB激活标志），发现INT-777引起的TGR5激活主要是影响NF-κB通路，表现是核内p65减少。使用SQ22536处理（这是一种有效的腺苷酸环化酶(AC) 抑制剂,抑制TGR5的下游信号），p65水平重回正常化。这建立了TGR5-cAMP-NF-κB的关系。
针对NF-κB通路，作者研究了I-κB磷酸化水平（I-κB磷酸化是p65入核前的一个过程），以及NF-κB-p65 DNA结合能力，可以得到与上述相一致的结果。（NF-κB通路是被抑制的）
作者又在RAW264.7转入了一个含有与NF--κB一致反应元件的NF--κB报告质粒，在INT-177作用下或TGR5过表达情况下，NF--κB的反应是减弱的，相反，当TGR5被shRNA沉默后，这种反应没有减弱且INT-777的处理无法产生显著性差异。SQ22536也抑制了这种影响。
为了进一步探索TGR5在抑制NF-κB中的作用，作者在CHO细胞中生成了一个小鼠TGR5蛋白突变体(TGR5-A217P)。含有该突变的TGR5不能激活cAMP-CREB信号通路。使用TGR5抗体证实了CHO细胞中野生型和突变型TGR5蛋白的表达。
在CHO细胞中转入了一个CREB的报告体系，TGR5-A217P在被INT-777激活时并没有增强CREB的活性，这表明它不能诱导cAMP信号通路。
同样，以核内p65表达量来评价两个细胞模型的NF-κB活性。TGR5野生型蛋白强烈抑制NF-κB的转录活性，但TGR5-A217P突变体未能调节NF-κB的活性。这表明TGR5激活对NF-κB的调控作用是依赖于TGR5与cAMP的。
上述结果表明TGR5-cAMP-NF-κB通路对抑制巨噬细胞中细胞因子的产生至关重要。 3、TGR5激活抑制氧化低密度脂蛋白摄取 上述的结果已经呈现了TGR5对巨噬细胞炎症的抑制作用和其中的关键通路，在动脉粥样硬化中，巨噬细胞向泡沫细胞转变是非常关键的一个步骤。巨噬细胞的TGR5是否会影响脂质装载与泡沫细胞的形成呢？作者分析了 Tgr5 / 与Tgr5- /-小鼠巨噬细胞上的清道夫受体A（SR-A）和分化簇36（CD36）（这二位都参与到脂质装载与泡沫细胞形成的过程中）。结果发现，Tgr5-/-小鼠分离的巨噬细胞中SR-A和CD36的mRNA水平更高，当予以INT-777巨噬细胞中Tgr5 / 小鼠SR-A和CD36 的mRNA水平降低。
对于脂质摄取，作者对氧化LDL修饰上Dil标签。可以显示出TGR5激动对于氧化LDL摄取的抑制作用。
4、TGR5激活可抑制动脉粥样硬化 文章构建了Ldlr-/-Tgr5 / and Ldlr-/- Tgr-/-小鼠作为模式动物（LDL受体缺失会导致动物体内的LDL水平升高，造成动脉粥样硬化），给这些动物高脂致AS的饮食以及在这些动物上施加或不施加INT-777来探究TGR5对于AS的作用。结果发现：同时观察到INT-777处理的Ldlr-/-Tgr5 / 小鼠主动脉根部的血管病变（斑块与血栓）形成显著减少。然而，在Ldlr-/-Tgr5-/-小鼠中没有观察到这种减少。
然而，INT-777并不影响两种基因型中胆固醇或甘油三酯的总水平，另外，与之前的观察结果一致，与未药物处理的Ldlr-/-Tgr5 / 小鼠相比，INT-777处理的斑块中TNFα和IL-1β mRNA水平显著降低，而INT-777在Ldlr-/-Tgr5-/-小鼠中没有观察到这种作用。
此外，文章分析了斑块组成，通过染色平滑肌细胞a-肌动蛋白(ASMA)检测平滑肌细胞(SMCs)，用MAC3检测巨噬细胞，用天狼星红染色胶原蛋白（胶原蛋白是AS病变部位的主要成分）。
与未处理的小鼠相比，INT-777处理Ldlr-/-Tgr5 / 小鼠的斑块中巨噬细胞含量减少，而在Ldlr-/-Tgr5-/-动物中没有观察到巨噬细胞含量的减少。
这些数据表明TGR5的激活抑制了血管病变的形成，并且这一过程与斑块内炎症的减少和巨噬细胞含量的降低有关。 5、INT-777通过激活白细胞中的TGR5来抑制动脉粥样硬化 那么怎样说明INT-777对动脉粥样硬化的抑制是由白细胞介导的？文章对Ldlr-/-动物进行了骨髓移植，将Tgr5 / 或Tgr5-/-的小鼠骨髓的嵌合入Ldlr-/-动物，这样仅限于Ldlr-/-动物的白细胞是Tgr5 / 或Tgr5-/-的，并从血液循环中抽取白细胞进行基因型鉴定。
如同上述处理两种移植动物（AS饮食与给INT-777）,对主动脉根部动脉粥样硬化评估后，观察到Tgr5 / 小鼠骨髓移植的Ldlr-/-小鼠在INT-777治疗后出现血管病变较少。在移植Tgr5-/-骨髓的Ldlr-/-小鼠中，INT-777对斑块形成的抑制作用完全消失。
综上所述，这些数据表明INT-777对动脉粥样硬化的影响是通过白细胞中TGR5的激活来介导的。 本文结果提示了巨噬细胞的TGR5在动脉粥样硬化疾病中的免疫调节作用和可能的抑炎与抑制脂质摄取的相关机制。同时，提示了工具药INT-777以及一些天然与半合成胆汁酸具有潜在的免疫调节活性。 |
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