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卷首语  终于讲到基因测序这一部分了，接下来的几篇文章，让我们好好聊一下基因测序这个问题吧。基因测序这个话题，我大致分为四篇文章来讲，第一篇先讲传统的第一代Sange法测序技术及其应用，第二篇讲建立在Sange法测序基础上的人类基因组测序计划，第三篇主要讲第二代测序也就是高通量测序技术及其应用，主要包括甲基化、SNP和转录组测序，第四篇主要讲目前科研上比较热的单细胞测序技术及其应用。  快 乐 聊 基 因 轻 松 做 科 研 Sange法测序的原理  Frederick Sanger（1918.8－2013.11） 在人类文明的发展史上，有些人一辈子注定就是为了发现某个理论或者发明某项技术而生的，比如孟德尔和遗传学说，比如麦克斯韦和电磁场，比如爱因斯坦和相对论，比如穆利斯和PCR，比如电视剧《暗算》里的黄依依和密码，再比如本文的主角Sange和他的一代测序。这些人就像精灵，为我们人类的科技发展指明了方向；又像划过夜空的流星，把毕生的精力浓缩成短暂的光芒，为我们人类的科技发展照明了道路。  Sange就是这样一位生物化学家，于1958年和1980年两次获得诺贝尔化学奖，是人类历史上第四位两度获得诺贝尔奖的科学家。巧的是这两次诺贝尔奖的获得都是因为测序，第一次是因为蛋白质的测序（胰岛素的氨基酸测序），第二次是因为发明了DNA测序技术，总觉得Sange这一辈子就是为了测序而生的。 脱氧单核苷酸（dNTP） 在讲Sange法测序原理之前，我们先来认识一下什么是脱氧单核苷酸（dNTP）。脱氧单核苷酸（dNTP）是组成DNA的基本单位 ，是一类由嘌呤或嘧啶碱基 、脱氧核糖以及磷酸这三种物质组成的小分子化合物 ，根据碱基的不同，脱氧单核苷酸可分为四类：腺嘌呤脱氧单核苷酸dATP、鸟嘌呤脱氧单核苷酸dGTP、胞嘧啶脱氧单核苷酸dCTP、胸腺嘧啶脱氧单核苷酸dTTP。  这四种脱氧单核苷酸通过核糖上的3'-C原子上的羟基与另一个脱氧单核苷酸上的磷酸缩合，形成了DNA单链，其结构如下：  这就像是一群人左手拉右手，形成了人链。  dNTP是DNA复制所需要的基本组成单位，人体的细胞增殖同样需要DNA的合成与复制，人体的消化系统将每天所吃的食物里边的DNA消化成单个的脱氧单核苷酸（dNTP），然后再根据自身需求合成人体自身的DNA，形成了人体内DNA的新陈代谢。 我们进行PCR扩增时，同样需要脱氧单核苷酸（dNTP）作为DNA链合成的基本单位，所以PCR的反应体系里边不可避免的都有dNTP。 双脱氧单核苷酸（ddNTP） 双脱氧单核苷酸（ddNTP）在天然产物里是不存在的，是人工合成的核苷类似物，在合成的时候，将核糖上的3'-C原子上的羟基去掉，那么我们就能得到四种双脱氧单核苷酸（ddNTP），如下图：  尽管结构上和脱氧单核苷酸非常类似，但是由于双脱氧单核苷酸缺少了核糖上的3'-C原子上的羟基，所以不能与另外的脱氧单核苷酸上的磷酸进行缩合反应，所以是不能进行DNA链的复制的，就像一群人左手拉右手时，其中一人的左手没了，下一个人拉不到此人的左手，所以此时人链的延长就被迫终止。  其中一人的左手没了，下一个人拉不到此人的左手 人链延长被迫终止 核苷类似物药物 根据核苷类似物可以终止DNA链复制延伸这个原理，人们开发了一系列的抗病毒、抗病菌和抗肿瘤药物，因为病毒也好，病菌也好，还是肿瘤细胞也好，它们的增殖都伴随着DNA的复制，终止了DNA的复制，病毒、病菌和肿瘤细胞的增值也就无从谈起。 当然了，这一类药物也会终止人体正常细胞的增值，尤其是更新比较快的细胞，更新越快，影响越大，比如胃粘膜细胞、比如毛囊细胞，比如生殖细胞等，这也是此类药物副作用的原因所在。所以一般服用这类药物一段时间，就会产生毛发脱落、恶心、无精少精、精子畸形等症状。凡是药品名称里带有“韦”、“定”的，大都属于此类药物。 Sange法测序的原理 简单来说，Sange法测序的原理就是分别将四种被放射性同位素标记（或者生物素、地高辛等发光基团）的双脱氧单核苷酸（ddATP*、ddTTP*、ddCTP*、ddGTP*）与正常的四种脱氧单核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），按照（1:100）左右的比例混合，在引物的引导下，四种混合单核苷酸（【ddATP*、dATP、dTTP、dCTP、dGTP】；【ddTTP*、dATP、dTTP、dCTP、dGTP】；【ddCTP*、dATP、dTTP、dCTP、dGTP】；【ddGTP*、dATP、dTTP、dCTP、dGTP】）在DNA聚合酶的催化下，逐个地将脱氧单核苷酸与模板互补配对结合，由于反应体系中混杂有双脱氧单核苷酸，所以一旦有双脱氧单核苷酸与模板结合，该DNA链就停止延伸，最终反应体系里会得到一系列长短不一的DNA链，经过纯化回收去除多余的双脱氧单核苷酸后，反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，长短不一的DNA单链就会根据分子量大小被分离开来，由于双脱氧单核苷酸被发光基团标记，所以通过放射自显影，长短不一的DNA单链就会被曝光在胶片上，最后通过对胶片的判读，得到待测DNA的碱基序列。如下图： Sange法测序的原理 Sange法测序对模板DNA的要求还是很高的，因为单核苷酸只是与模板进行了聚合反应，反应产物没有任何增加，所以对模板DNA的需求量比较大；操作也比较复杂，需要四个反应管来进行聚合反应，电泳时需要四个加样孔同时进行聚合产物的加样和电泳；除此之外，结果的判读也比较麻烦，因为随着测序长度的增加，碱基序列越长，聚丙烯酰胺凝胶电泳越不容易分离，就像1bp和2bp，差了两倍，这个电泳很容易就能分离开来；但是100bp和101bp呢，只有1%的差异，假如序列再长一些呢，显然就很难精确分开了，而且不同的人也会有不同的判读结果。 Sange在判读测序结果 Sange在1977年，发明创立了链终止法测序技术，在分子生物学的研究上得到了广泛的应用，PCR技术发明以后，人们根据PCR的技术原理对Sange法测序进行了改进，同时毛细管电泳代替了平板式的凝胶电泳，出现了商业化的全自动测序仪，使得测序的效率大大提高，2001年人类基因组测序计划完成。 改进后的Sange测序法 PCR技术出现以后，人们主要在以下四个方面对Sange测序法进行了改进： 1、测序试剂不再分为四种单独双脱氧单核苷酸，而是将四种双脱氧单核苷酸（ddNTP）按照一定比例与正常的四种脱氧单核苷酸混合在一个反应管里，后续的聚合反应也不需要在四个反应管里分别进行，只需在一个反应管里进行即可。比如AB公司的测序试剂就是BigDyeTM就是如此。 2、四种双脱氧单核苷酸不再是统一的放射性标记，而是改为四种不同的荧光基团标记，比如ddTTP，红荧光集团标记；ddATP，绿色荧光集团标记；ddCTP，黄色荧光集团标记；ddGTP蓝色荧光集团标记。 3、单链PCR代替了单纯的聚合反应，使得测序模板的需求量大为下降。改进后的Sange法测序也可以说是一种比较另类的PCR，PCR反应中只有一侧引物，一般经过25个PCR循环即可，所以单链PCR产生的系列长短不一的短片段的量也是传统Sange测序法的25倍，同时这也是测序反应可以双向进行的原因所在，既可选择上游引物进行测序PCR反应，也可选择下游引物进行测序PCR反应。 4、毛细管电泳代替了传统的大胶板电泳，与传统的Sange测序法使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳仪相比，毛细管电泳分辨率更高，可以有效分离出600bp和601bp的碱基差异，而且毛细管电泳配合高灵敏度检测器可实现自动化的序列判读，这比人工判读测序结果精确得多。 传统的Sange测序法所使用的电泳胶板 毛细管测序原理示意图 经典的一代测序仪有AB公司的3500XL和3730XL，3500XL测序仪有24道毛细管，3730XL有96道毛细管。 AB公司3730XL测序仪 AB公司3500测序仪 其实PCR测序原理很简单，就是PCR和毛细管电泳。上图大家看到的大机壳子只是测序仪的毛细管电泳和毛细管电泳检测这一部分，这一部分只是执行单链PCR结束后的毛细管电泳以及电泳结果的检测与最终的序列判读。DNA测序系统主要包括PCR仪、测序仪、台式高速冷冻离心机、BigDyeTM试剂、毛细管测序胶等。测序需要的模板一般是装载有PCR产物的质粒或者PCR结束后的胶回收纯化产物，经过单链PCR扩增后，PCR扩增产物经过纯化去除多余的双脱氧单核苷酸，然后即可进行毛细管电泳以及测序结果的分析。 DNA测序结果 目前一代测序是DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR等检测分析的最佳选择，除了可进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。尽管目前高通量的二代测序技术不断涌现，但是一代测序仍旧是DNA测序的金标准。 快 乐 聊 基 因 轻 松 做 科 研 亲子鉴定与个体识别 近些年我们经常在新闻里看到有关亲子鉴定以及个体识别的相关报道，通过父母和孩子的一滴血或者几根头发就可以准确地鉴定出和孩子是否有亲缘关系；再或者通过犯罪现场的遗留的毛发、精液（精斑）、烟蒂（烟蒂上带有少量口腔细胞）等痕量物证，就可以锁定犯罪嫌疑人。这一切究竟是怎么做到的？亲子鉴定和个体识别到底是个什么鬼？背后的原理又是什么？ 犯罪现场的物证收集 其实亲子鉴定和个体识别原理上比DNA测序简单的多，仅仅是简单的PCR扩增和毛细管电泳而已，而且还是正常的PCR扩增，不需要复杂的DNA测序试剂，甚至连连DNA的具体序列都不用知道，只需将孩子的PCR毛细管电泳结果与父亲或者母亲的PCR毛细管电泳结果进行比较即可；个体识别亦是如此。接下来就让我们详细地来看看亲子鉴定和个体识别到底是个什么东西。 亲子鉴定 我们都是由父母双方的精子和卵子结合形成的受精卵发育而来的，所以我们细胞内的两条染色体都是来自父母双方染色体的其中一条，如下图所示： 在讲述亲子鉴定之前，让我们先了解一下DNA序列中的的微卫星序列。 人类一个细胞中的DNA大概有30亿个碱基，其中有一类DNA序列被称为“微卫星DNA序列”，这一类DNA序列有很多重复的DNA短片段，也被称为短串联重复序列(STRs)，比如： TGTCTTCGACGACCACGGACACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGTCGATACACTCCACAGAGGCA 不知道大家注意带没有，这段序列当中有16个“ACTG”的重复，这就是DNA上的一个短串联重复序列(STRs)，类似的不同序列的重复DNA短片段在人类的染色体上有很多种。 现在我们在短串联重复序列的两端设计上、下游引物，PCR扩增这个短链重复序列，PCR结束后毛细管电泳检测，一个人此处的短串联重复序列PCR检测结果为：（16，17），这表明此人的两条染色体上此处的短串联重复序列分别有16个重复和17个重复，这16个重复和17个重复是由于人的两条染色体分别来自于父母双方，父亲其中的一条染色体上此处的短串联重复序列有16个重复，父亲的这条染色体遗传给了这个人；母亲其中的一条染色体上此处的短串联重复序列有17个重复，母亲的这条染色体也遗传给了这个人；也可能是父亲的17个，母亲的16个。反正这个人的两条染色体在此处的短串联重复序列分别有16个重复和17个重复，都是来自于父母双方的其中一条染色体。 短串联重复序列的毛细管电泳结果示意图 现在为了做亲子鉴定，我们分别抽取父母双方和孩子的血液提取DNA，然后选择DNA上23个不同的短串联重复序列分别作PCR然后进行毛细管电泳，最后形成的检测报告结果如下： 一共23个检测位点，除了绿色标注的D8S1179、D18S51、D19S433、D13S317这四个位点，其他的位点都符合孟德尔遗传规律。现在我们来看看D8S1179、D18S51、D19S433、D13S317这四个位点的检测结果： D8S1179位点，孩子的检测结果是（12,17），母亲的检测结果是（16,17），显然孩子该位点检测结果里的17是来自于母亲的（16,17）里的17；但是孩子该位点的另一个检测结果12却不在父亲的检测结果里（14,15）； D18S51位点，孩子的检测结果是（15,22），母亲的检测结果是（14,15），显然孩子该位点检测结果里的15是来自于母亲的（14,15）里的15；但是孩子该位点的另一个检测结果22却不在父亲的检测结果里（20,21）； D19S433位点，孩子的检测结果是（12,13），母亲的检测结果是（13,13），显然孩子该位点检测结果里的13是来自于母亲的（13,13）里的13；但是孩子该位点的另一个检测结果12却不在父亲的检测结果里（14,15）； D13S317位点，孩子的检测结果是（12,13），母亲的检测结果是（9,13），显然孩子该位点检测结果里的13是来自于母亲的（9,13）里的13；但是孩子该位点的另一个检测结果12却不在父亲的检测结果里（11,14)。 一般来说，只要有三个检测位点不符，即可排除亲缘关系，现在孩子有四个检测位点与父亲不符，所以可以直接排除孩子与父亲之间的亲缘关系。 如果孩子的检测结果里边只有一个或者两个位点与父亲的不符，那有可能是夫妻的精子卵子结合后受精卵产生了DNA的重排（概率极低），这时候要计算亲权指数，假如亲权指数相加大于100，即可认定孩子与父亲存在亲缘关系，假如亲权指数相加小于100，即可排除孩子与父亲存在亲缘关系。 个体识别 个体识别的原理和亲子鉴定相同，而且比亲子鉴定更简单，只要将案发现场的痕量物证（毛发、精液、精斑、烟蒂等）进行DNA的短串联重复序列的检测与分析，然后与犯罪嫌疑人的DNA短串联重复序列的检测结果进行比较即可，只要比较结果吻合，就可以锁定犯罪嫌疑人，当然了假如犯罪嫌疑人有同卵双生的双胞胎，那么犯罪嫌疑人肯定是其中一个或者两个同时参与实施了犯罪。 快 乐 聊 基 因 轻 松 做 科 研 微信号｜瑞鼎基因花园 |
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