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生 化     小 课   医学生：生理生化 必有一挂 生科/生技：生化书是我见过最厚的教材 没有之一 每周一堂 生化小课 —— 期末/考研 逢考必过——  蛋白质可以被分离和纯化 在确定蛋白质的性质和活性之前，通常必须进行纯化制备。鉴于细胞含有数千种不同的蛋白质，那么如何才能纯化一种蛋白质呢?分离蛋白质的方法利用了不同蛋白质的不同性质，包括大小、电荷和结合性质。基因工程方法的出现为蛋白质纯化提供了新的和更简单的途径。后一种方法，如第九章所述，通常人为地修饰被纯化的蛋白质，在一端或两端添加少量或多个氨基酸残基。在许多情况下，这些修饰改变了蛋白质的功能。未改变的天然蛋白的分离需要去除修饰或依赖此处所述的方法。 蛋白质的来源通常是组织或微生物细胞。任何蛋白质纯化程序的第一步都是打开这些细胞，将它们的蛋白质释放到称为粗提物的溶液中。如有必要，差速离心可用于制备亚细胞组分或分离特定的细胞器。 一旦提取物或细胞器准备就绪，就可以使用各种方法来纯化其中包含的一种或多种蛋白质。通常，对提取物进行处理，根据大小或电荷等特性将蛋白质分离成不同的部分（ fractions）；该过程称为分馏（fractionation）。纯化中的早期分馏步骤利用蛋白质溶解度的差异，这是 pH、温度、盐浓度和其他因素的复杂函数。在某些盐的存在下，蛋白质的溶解度会降低，这种效应称为“盐析”。硫酸铵 ((NH4)2SO4) 对于选择性沉淀某些蛋白质而将其他蛋白质留在溶液中特别有效。然后使用低速离心从溶液中残留的蛋白质中去除沉淀的蛋白质。 在可能进行后续纯化步骤之前，通常必须进一步改变含有目标蛋白质的溶液。例如，透析是一种利用蛋白质的较大体积将蛋白质与小溶质分离的过程。将部分纯化的提取物置于由半透膜制成的袋子或管子中，将其悬浮在体积大得多的适当离子强度的缓冲溶液中。该膜允许盐和缓冲液的交换，但不允许交换蛋白质。因此透析将大蛋白质保留在膜袋或管内，同时允许蛋白质制剂中其他溶质的浓度发生变化，直到它们与膜外的溶液达到平衡。例如，透析可用于从蛋白质制剂中去除硫酸铵。 分离蛋白质最有效的方法是使用柱层析(column chromatography)，它利用了蛋白质电荷、大小、结合亲和力和其他特性的差异（图 3-16）。具有适当化学性质的多孔固体材料（固定相）固定在色谱柱中，缓冲溶液（流动相）通过它迁移。溶解在用于建立流动相的相同缓冲溶液中的蛋白质在柱的顶部分层。然后蛋白质在较大的流动相中作为不断扩展的条带渗入固体基质。单个蛋白质在色谱柱中迁移得更快或更慢，具体取决于它们的特性。   离子交换层析(Ion-exchange chromatography)利用了给定pH下蛋白质净电荷正负号和大小的差异（图 3-17a）。色谱柱基质是一种含有结合带电基团的合成聚合物（树脂）；结合阴离子基团的称为阳离子交换剂，结合阳离子基团的称为阴离子交换剂。每种蛋白质对柱上带电基团的亲和力受pH值（决定分子的电离状态）和周围溶液中竞争性游离盐离子浓度的影响。可以通过逐渐改变流动相的pH值和/或盐浓度来优化分离，以创建pH值或盐梯度。在阳离子交换色谱（cation-exchange chromatography）中，带净正电荷的蛋白质比带净负电荷的蛋白质在基质中的迁移速度更慢，因为前者的迁移因与固定相的相互作用而受到更多阻碍。   当含有蛋白质的溶液从色谱柱中流出时，这种流出物的连续部分(馏分)被收集在试管中。每个部分都可以测试感兴趣蛋白质的存在以及其他特性，如离子强度或总蛋白浓度。所有对目标蛋白质呈阳性的组分都可以结合为蛋白质纯化的色谱步骤的产物。 图3-17显示了除离子交换之外的柱层析的两种变体。尺寸排阻层析(Size-exclusion chromatography)，也称为凝胶过滤（图 3-17b），根据尺寸分离蛋白质。在这种方法中，大蛋白质比小蛋白质更快地从柱子中出来——这是一个有点违反直觉的结果。固相由具有特定尺寸的工程孔或空腔的交联聚合物珠组成。大型蛋白质无法进入空腔，因此在珠子周围通过柱子的路径更短（更快）。小蛋白质进入空腔，并通过更曲折的路径通过色谱柱而减慢速度。尺寸排阻层析也可用于估计被纯化蛋白质的大小，使用类似于图3-19中描述的方法。 亲和层析(Affinity chromatography)基于结合亲和力（图 3-17c）。色谱柱中的珠子有一个共价连接的化学基团，称为配体——一种与蛋白质等大分子结合的基团或分子。当将蛋白质混合物添加到柱中时，任何对该配体具有亲和力的蛋白质都会与珠子结合，并阻碍其通过基质的迁移。例如，如果蛋白质的生物学功能涉及与ATP的结合，则将类似于ATP的分子连接到柱中的珠子上会产生一个亲和基质，有助于纯化蛋白质。不与ATP结合的蛋白质流过色谱柱的速度更快。然后，结合的蛋白质被含有高浓度盐或游离配体（在本例中为 ATP 或 ATP 类似物）的溶液洗脱。盐会削弱蛋白质与固定化配体的结合，从而干扰离子相互作用。游离配体与附着在微珠上的配体竞争，从基质中释放蛋白质；从柱子上洗脱的蛋白质产物通常与用于洗脱它的配体结合。 蛋白质纯化方案通常使用基因工程将额外的氨基酸或肽（标签）融合到目标蛋白质上。亲和层析可用于结合该标签，在一个步骤中实现纯度的大幅提高（见图 9-11）。在许多情况下，随后可以移除标签，从而完全恢复天然蛋白质的功能。 色谱法通常通过使用HPLC或高效液相色谱法得到增强。HPLC利用高压泵加速蛋白质分子向下移动；它还使用更高质量的色谱材料，可以承受加压流的压碎力。通过减少柱上的传输时间，HPLC可以限制蛋白质条带的扩散，从而可以大大提高分辨率。 选择纯化先前未分离的蛋白质的方法既受既定先例的指导，也受常识的指导。在大多数情况下，必须依次使用几种不同的方法来完全纯化蛋白质，每种方法都根据不同的性质分离蛋白质。方法的选择有些经验主义，在找到最有效的策略之前可能会尝试多种策略。研究人员通常可以通过将新程序建立在为类似蛋白质开发的纯化技术的基础上，最大限度地减少试验和错误。常识表明，当污染物的总体积和数量最大时，应首先使用盐析等廉价程序。随着每个纯化步骤的完成，样品量通常会变小（表 3-5），这使得在后期使用更复杂（和昂贵）的色谱程序变得可行。纯化表记录了纯化方案中每个步骤的成功。在表3-5所示的假设纯化中，最终比活性（15,000单位/mg）与起始比活性（10 单位/mg）之比给出了纯化因子 (1,500)。最后一步的总活性（45,000单位）相对于起始材料的总活性（100,000单位）的百分比给出了纯化程序的产率 (45%)。 Principles of Biochemistry 本栏目信息及图片均来源于Lehninger Principles of Biochemistry 第八版，其中文字信息为英文原版的小编翻译/整理版，仅供学习交流使用，欢迎在留言区或私信听课君提供宝贵意见，如有侵权请联系删除。 部分WORKED EXAMPLE及全部Chapter Review未纳入翻译整理范围，如有需要建议参考原版图书该部分内容学习。
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