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为了帮助大家理解，小远在解析表观遗传学的工具——ChIP-seq（一）中介绍了许多基础知识，有了基础知识做铺垫很多东西理解起来就会更加容易。当时由于篇幅的原因，有些知识点只是简单提了提，没有具体展开，而今天的内容主要是给大家介绍ChIP-seq应用的一些文献实例，如果在这个过程中涉及到一些比较重要的知识点，小远还是会给大家继续解释的哦！别走开，正文马上就要开始啦！ 点这里看解析表观遗传学的工具——ChIP-seq（一）。 05 ChIP-seq实验的应用 5.1 研究组蛋白的修饰情况 在前面的文章中我们简单提了提组蛋白的修饰，为了让大家能够更清楚、更直观地理解这个概念，小远还是决定给大家再介绍一些基础知识，这里先帮大家温故一下核小体的概念：核小体是染色质的基本结构单位，由组蛋白八聚体和缠绕在外的DNA组成（图1）。细心的你们一定会发现每个组蛋白上都伸出了一小段“线头”，这是蛋白质的N端，也叫尾巴（tail）。而组蛋白修饰就是在这个尾巴上进行的。因为这个尾巴从核心结构中突出（图1）(Kimura Hiroshi, 2013)，更适合与相邻环境进行相互作用，因此易受翻译后修饰（PTM）的影响。在四种不同的组蛋白质中，组蛋白H3和H4的尾部比H2A和H2B更容易发生PTM(Torres-Perez et al., 2021)。
图1 组蛋白结构。 常见的组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，图2展示了各个组蛋白中的修饰情况(Huang et al., 2014)。组蛋白发生修饰后会使染色质的构象等发生变化，从而影响了DNA与组蛋白之间的相互作用，进而调控基因的转录表达。
图2 组蛋白修饰(Huang et al., 2014)。 由于组蛋白修饰的类型众多，因此在描述组蛋白修饰时一般按照“组蛋白名称 氨基酸名称 氨基酸位置 修饰类型”的规则进行描述，例如：H3K4me1和H3K27ac，其具体的含义在前面的文章中已经介绍过了，这里就不再解释了。 下面我们以组蛋白乙酰化和甲基化为例，浅谈一下ChIP-seq技术在这方面的应用，通过上面的介绍，大家也看到了组蛋白的修饰类型非常多，想要通过几篇文献就了解清楚是不太可能的，所以大家除了看小远给大家列举的文献之外还需要自己去下功夫哦！ 案例一 ：组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化主要与基因激活有关，组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调进行。 在真核细胞中，组蛋白受到大量的翻译后修饰，其依次或组合作用会影响染色质的结构和基因组功能。在“H3K36ac Is an Evolutionary Conserved Plant Histone Modification That Marks Active Genes”一文中，作者发现组蛋白H3的lys36位点乙酰化（H3K36ac）是植物中一个新的染色质修饰位点。H3K36ac修饰在种子植物中是进化保守的，包括裸子植物挪威云杉（Picea abies）、被子植物水稻（Oryza sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）。在拟南芥中，H3K36ac在常染色质中富集，而在异染色质中不富集。全基因组染色质免疫沉淀测序实验（ChIP-seq）显示，H3K36ac峰位于基因的5'端，主要位于转录起始位点远端的两个核小体上，与基因长度无关。 对于上面的这些结果，具体解析如下：作者首先利用质谱鉴定了lys36是新的乙酰化位点，接着为了验证和扩展质谱结果，作者利用PAGE分离拟南芥花序组蛋白提取物，并用抗H3K36ac的抗体进行探针检测。该抗体之前使用修饰和未修饰的多肽进行了斑点印迹和蛋白质免疫印迹的特异性测试，并通过ChIP-seq进行了验证(Morris et al., 2007；Egelhofer et al., 2011)。该抗体与11个不同的乙酰化组蛋白肽（H2AK5ac，H3K14ac，H3K18ac，H3K27ac，H3K4ac，H3K9ac，H4K12ac，H4K16ac，H4K5/8/12/16ac，H4K5ac和H4K8ac）以及许多未修饰或甲基化的组蛋白肽均无交叉反应。拟南芥组蛋白提取物的阳性信号（图3A）证实了植物中H3K36ac修饰的质谱鉴定结果。 利用抗H3K36ac抗体对拟南芥根尖细胞核进行免疫染色，以确定H3K36ac在拟南芥细胞核中的分布。H3K36ac在核仁和4',6-二氨基-苯乙烯醇（DAPI）致密的染色体中心中没有荧光信号，染色体中心主要由着丝粒和着丝粒间重复序列组成。相比之下，H3K36ac染色可见于正染色区域（图3B-E），表明大多数H3K36ac与较少浓缩、基因丰富的区域以及可能的活性基因相关。为了验证这一预测，使用抗H3K36ac和抗H3的抗体进行甲醛交联ChIP（X-ChIP）。事实上，H3K36ac在转录的常染色质ACTIN7基因中含量较高，而在沉默的异染色质Ta2转座子中含量较低（图3F）。Ta2处H3信号的增加与早期报道一致，可能与异染色质中更致密的染色质结构有关(Rehrauer et al., 2010; Shu et al., 2012)。这些结果表明，H3K36ac存在于常染色质的活性基因上，而不存在于异染色质上。
图3 拟南芥中H3K36ac的检测(Mahrez et al., 2016)。（A）从拟南芥花序中提取的组蛋白在15%的SDS-PAGE凝胶上分离，然后使用抗H3和抗H3K36ac的抗体进行蛋白免疫印迹。（B，C）H3K36ac在根尖细胞核中的定位。利用DAPI（B）对拟南芥根尖间期细胞核进行染色，并用抗H3K36ac的抗体（C）进行免疫荧光分析。（D）DAPI和H3K36ac信号的叠加。图中的白线表示使用ImageJ软件进行分析通过细胞核的截面。（E）DAPI（蓝色）和H3K36ac（红色）荧光强度的定量线谱。（F）X-ChIP检测采用IgG、抗H3和抗H3K36ac的抗体，而引物是针对活性的ACTIN7基因和沉默的Ta2转座因子。 接着，作者进行了天然状态下的ChIP-seq实验，以确定H3K36ac在单核细胞分辨率下的全基因组定位。具体结果如下：
图4 H3K36ac在基因间的分布(Mahrez et al., 2016)。（A）H3K36ac在TSS（左图）和TTS（右图）周围富集的宏基因图。在TSS远端500bp处富集程度最高。（B）H3K36ac富集与基因长度无关。宏基因图显示为第一个（黑色），第二个（红色），第三个（绿色）和第四个（蓝色）长度的四分位数，其中黑线表示25%的最短基因。（C）基因特异性H3K36ac评分的分布，定义为在TSS远端35-516bp区间范围内的平均H3K36ac信号。注意两个得分分别小于或多于27的独立基因群体。（D）H3K36ac评分与转录状态的关系。H3K36ac评分分别显示了mRNA水平最低（红色）和最高（绿色）的10%的基因。（E）最低（红色）mRNA水平和最高（绿色）的10%基因TSS周围的H3K36ac宏基因图。只有活性基因在前500bp内具有特征性的H3K36ac峰。 案例二：组蛋白甲基化 组蛋白甲基化取决于其位置和状态，与抑制或激活有关。组蛋白甲基化的位点是赖氨酸和精氨酸。赖氨酸可以分别被一、二、三甲基化，精氨酸只能被一、二甲基化。下面给大家列举的例子讲到的主要是组蛋白甲基化的功能。 全球变暖严重影响了植物的开花时间和繁殖成功率。前信使RNA（pre-messenger RNA, pre-mRNA）的选择性剪接是植物环境温度调控反应的重要机制，但其具体的调控机制尚不清楚。在拟南芥中，温度升高通过改变关键调控基因的剪接，促进植物形态的变化以及从营养期到生殖期的转变。在“Histone H3 lysine 36 methylation affects temperature-induced alternative splicing and flowering in plants”一文中，作者研究了一种特定的组蛋白修饰是否会影响环境温度诱导的选择性剪接和开花时间。 作者采用全基因组方法，进行RNA测序（RNA-seq）分析和不同环境温度下植物的H3组蛋白36号赖氨酸三甲基化（H3K36me3）的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）。对这些数据集的分析和比较表明，温度诱导的差异剪接基因在H3K36me3中富集。此外，作者发现H3K36me3沉积的减少会导致温度诱导的选择性剪接的改变。 最后的结果表明，组蛋白标记H3K36me3在剪接调控和植物对环境温度波动的可塑性方面发挥了关键作用。作者的发现为作物育种开辟了新的前景，从而更好地应对气候变化导致的环境变化。
图5 温度诱导的差异剪切（Differentially spliced，DiS）基因在H3K36me3中富集(Pajoro et al., 2017)。（a）不同类型基因的转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TTS）周围的H3K36me3图谱。（b）与温度诱导的DiS事件相关的基因H3K36me3谱。 小远叨叨 关于组蛋白的修饰就介绍到这里，这一块的内容其实非常丰富，但小远不可能面面俱到，所以剩下的就只能靠大家自己查阅文献资料了！ 5.2 研究转录因子结合位点 对于这一块的内容大家在日常研究中应该经常遇到，在之前的文章中，小远介绍的比较多的是通过启动子去找与其结合的转录因子，用到的方法是酵母单杂筛库。那么这里要给大家介绍的就是已知一个转录因子，如何去寻找与其结合的启动子的方法，下面就通过一篇文献和小远一起直观地去感受这个方法该怎么用吧！ 宿主植物对病原体的识别导致快速的转录重排和防御反应的激活。许多防御调节因子的表达在此过程中被诱导，但它们在转录上如何被调控的机制在很大程度上是未知的。在“ChIP-seq reveals broad roles of SARD1 and CBP60g in regulating plant immunity”一文中，作者通过染色质免疫沉淀测序发现，转录因子SARD1和CBP60g与大量编码植物免疫关键调控因子的基因启动子区结合。具体结果如下： 在自身启动子下表达SARD1-HA融合蛋白的sard1 cpb60g突变株中，病原体诱导的ICS1表达恢复到与cbp60g单突变株相似的水平，表明SARD1-HA的功能与野生型SARD1蛋白类似。为了鉴定SARD1的靶向基因，作者利用抗HA的抗体在自身启动子下表达SARD1-HA融合蛋白的转基因植物上进行ChIP实验。免疫沉淀的DNA用Illumina测序。对ChIP测序（ChIP-seq）数据的分析显示了×20的基因组覆盖深度。 绘制基因组上每个位置的序列覆盖范围，以确定拟南芥基因组中的峰。基因区域的峰分析表明，大部分序列峰位于翻译起始位点上游的1.5kb区域，包括5'-UTRs和启动子区域。去除阴性对照中序列峰相似的基因后，在84个基因的内含子、60个基因的3'-UTRs和1902个基因翻译起始位点上游1.5kb区域中发现了高度≥90的峰。作者的分析重点是在翻译起始位点上游1.5kb区域包含高度为90或更高的峰的组，因为它包含许多编码已知的植物防御调控基因，这些基因被病原体感染强烈诱导（表1）。这些已知的防御调控因子的启动子和编码区序列reads的分布见图6。
图6 补充数据1（本文中没有展示，感兴趣的同学可以自己去下载补充数据1）中基因启动子和编码区序列reads的分布。纵轴表示序列读取的次数。横轴表示染色体上的位置。翻译起始位点的位置用读取行标记。靠近序列峰的GAAATTT基序的位置用箭头表示。 Psm，用P.s.m.浸润处理的SARD1-HA转基因植株的序列分布。ES4326，-Psm，未经处理的SARD1-HA转基因植物的序列分布。 ChIP-seq鉴定的SARD1的候选靶基因之一是WRKY70（表1），它能够调节snc2-1D中水杨酸（Salicylic acid，SA）独立的防御反应(Zhang et al., 2010)。对抗HA抗体免疫沉淀的DNA进行定量PCR分析，证实WRKY70是SARD1的结合靶点（图7a）。在自身启动子表达CBP60g-HA融合蛋白的sard1cpb60g突变体植株中，病原体诱导的ICS1表达恢复到与sard1单突变体相似的水平，表明CBP60g-HA的功能与野生型蛋白相似。为了确定WRKY70是否也是CBP60g的结合靶点，作者使用抗HA的抗体在在其自身启动子下表达CBP60g-HA融合蛋白的转基因植物上进行了ChIP-PCR实验。如图7b所示，CBP60g也靶向WRKY70的启动子区域。
图7 SARD1和CBP60g可调控WRKY70的表达(Sun et al., 2015)。通过ChIP-PCR检测SARD1（a）和CBP60g（b）与WRKY70启动子的结合。将25日龄野生型植株和SARD1-HA（a）或CBP60g-HA（b）转基因植株的叶片在收样前用P.s.m. ES4326（OD600=0.001）渗透处理24h，并与1%甲醛交联。用抗HA抗体和protein A琼脂糖珠免疫沉淀SARD1-HA和CBP60g-HA染色质复合物。使用免疫球蛋白G（IgG）平行进行阴性对照反应。采用WRKY70启动子特异性引物对免疫沉淀的DNA样品进行实时定量PCR检测。ChIP结果以折叠变化表示，将ChIP的信号与IgG对照分离，设为1。（c）WRKY70在上述基因型中的表达与ACTIN1归一化。 小远叨叨 通过这个例子我们可以看到，如果想要筛选一个转录因子结合的启动子是什么，可以用ChIP-seq的方法，筛选出来之后验证某个具体的启动子是否是该转录因子的靶启动子，用到的方法是ChIP-qPCR（本文献中写的是ChIP-PCR）的方法哦！ 5.3 ChIP-seq研究核小体定位图谱 核小体定位影响转录因子（TFs）的结合位点和基因表达。对植物、动物和真菌模型的研究表明，沿着基因的核小体定位模式相似，以及占用和表达之间具有相关性。然而，植物核小体定位、顺式调控元件可及性与基因表达之间的关系尚不明确。在“Determinants of nucleosome positioning and their influence on plant gene expression”一文中表明：植物核小体损耗发生在特定的6-mer基序上，这种序列特异性核小体损耗可以预测表达水平。与酵母不同，拟南芥的核小体缺失区域往往具有较高的G/C含量，并以特定的G/C且富含6-mers为中心，这表明内在的序列特性，如G/C含量，不能完全解释植物核小体的定位。这些6-mer基序位点表现出较高的DNase I超敏反应，两侧有强相控的核小体，与已知的TF结合位点一致。有趣的是，这种6-mer特异性核小体耗尽模式不仅发生在启动子中，也发生在基因区域，并与较高的基因表达显著相关，这一现象在水稻中也存在，但在酵母中没有。在对防御激素茉莉酸处理敏感的基因中富集的6-mer基序中，核小体占用率没有显著变化，这表明这些位点可能是预先处理的，可以在不显著改变染色质状态的情况下实现快速反应。 作者的研究为核小体占用和基序序列的共同作用提供了一个全面的评估，它们可能是控制植物基因表达的顺式元件。另外，作者的发现为进一步了解染色质状态对植物转录调控通路的影响铺平了道路。
图8 核小体占用率与基因表达的关系(Liu et al., 2015)。（A）不同转录水平的蛋白编码基因（0-10类基因的表达百分位数）的转录起始位点（TSS，左图）和转录终止位点（TTS，右图）两侧的核小体占据谱。NOC：每个碱基上基因核小体占用分数的中位数。（B）以TSS（左）和TTS（右）侧翼100bp区段中的核小体占用率为预测因子，作为预测基因表达的线性回归模型的回归系数。R2：整个模型的决定系数。误差条：5th和95th置信区间。（C）除了使用裸gDNA数据外，与（B）相同。 小结 本文到这里就结束了，这篇文章主要介绍了ChIP-seq的应用，并列举了对应的文献。由于篇幅的原因小远给大家展示的文献并不多，如果大家想对ChIP-seq了解的更加透彻，还需要自己多多看文献，只看本文中的相关文献还远远不够哦！另外，在之前的文章中给大家介绍的关于ChIP-seq的应用还包括检测DNA的甲基化，但是小远找了很久没有找到相关的文献，对于检测DNA甲基化的研究用到的方法包括：亚硫酸氢盐修饰后测序法（BSP）、亚硫酸盐修饰后的限制性内切酶法（COBRA）、甲基化特异性的PCR法（Methylation-Specific PCR，MSP）、NGS甲基化测序法、HRM（高分辨率熔解曲线）法和焦磷酸测序法等。如果大家遇到利用ChIP-seq研究DNA甲基化的文献可以与小远一起讨论交流哦！ References： Egelhofer T A, Minoda A, Klugman S, et al. An assessment of histone-modification antibody quality[J]. Nature structural & molecular biology, 2011, 18(1): 91-93. Huang H, Sabari B R, Garcia B A, et al. SnapShot: histone modifications[J]. Cell, 2014, 159(2): 458-458. Kimura H. Histone modifications for human epigenome analysis[J]. Journal of human genetics, 2013, 58(7): 439-445. Liu M J, Seddon A E, Tsai Z T Y, et al. Determinants of nucleosome positioning and their influence on plant gene expression[J]. Genome research, 2015, 25(8): 1182-1195. Mahrez W, Arellano M S T, Moreno-Romero J, et al. H3K36ac is an evolutionary conserved plant histone modification that marks active genes[J]. Plant physiology, 2016, 170(3): 1566-1577. Morris S A, Rao B, Garcia B A, et al. Identification of histone H3 lysine 36 acetylation as a highly conserved histone modification[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(10): 7632-7640. Pajoro A, Severing E, Angenent G C, et al. Histone H3 lysine 36 methylation affects temperature-induced alternative splicing and flowering in plants[J]. Genome biology, 2017, 18(1): 1-12. Rehrauer H, Aquino C, Gruissem W, et al. AGRONOMICS1: a new resource for Arabidopsis transcriptome profiling[J]. Plant physiology, 2010, 152(2): 487-499. Shu H, Wildhaber T, Siretskiy A, et al. Distinct modes of DNA accessibility in plant chromatin[J]. Nature Communications, 2012, 3(1): 1-9. Sun T, Zhang Y, Li Y, et al. ChIP-seq reveals broad roles of SARD1 and CBP60g in regulating plant immunity[J]. Nature communications, 2015, 6(1): 1-12. Torres-Perez J V, Irfan J, Febrianto M R, et al. Histone post-translational modifications as potential therapeutic targets for pain management[J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2021, 42(11): 897-911. Zhang Y, Yang Y, Fang B, et al. Arabidopsis snc2-1D activates receptor-like protein-mediated immunity transduced through WRKY70[J]. The Plant Cell, 2010, 22(9): 3153-3163. 向上滑动查看更多文献 NO.1 好文推荐 Historical articles 启动子脱单的故事 进来抄作业，启动子要这么选！ 【干货】启动子研究方法高质量总结 天呐！这个实验系统也太强大了吧！ 酵母杂交那些事儿（一） 解析表观遗传学的工具——ChIP-seq（一） NO.2 伯远生物可提供以下技术服务及试剂 Technical service 分子生物学载体构建 十七大植物遗传转化 各物种基因编辑全套服务 分子检测服务 蛋白-蛋白、蛋白-核酸相互作用筛选及验证 伯远严选试剂商城-伯远严选，为你而选！ |
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