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01结构与调节 II类PI3K (class II PI3K)，也称为PI3KC2，是由唯一具有底物选择性且结构域呈延伸构象的家族，其组成的结构域含C端C2结构域 (PI3KC2中的“C2”指代C2结构域，而非class 2)。该家族可进一步分为α、β和γ三种亚型，分别由PIK3C2A、PIK3C2B和PIK3C2G编码。I类和III类PI3K的调节亚基与激酶形成组成性的相互作用，相比之下，PI3KC2中的调节亚基可能被其延展的结构域所取代 (图1)。PI3KC2催化PI和PI4P的3-OH磷酸化，因此，它们可能作为III类PI3K合成PI3P替代途径，也可能是I类PI3K和5-OH磷酸酶介导的PI(3,4)P2的生成的替代途径。这两种产物在生理上似乎都与PI3KC2功能相关，这点将在之后进一步讨论。近期发表的关于C2α亚型的晶体结构揭示了其活化环中相邻的Arg和Lys如何赋予激酶以结合PI4P的能力，这种对PI的选择性在III类PI3K中是缺乏的。 PI3KC2α亚型由C2结构域、Ras结合结构域 (Ras-binding domain, RBD)以及催化核心中的的螺旋结构域和激酶结构域共同组成 (图1)。其催化核心与I类PI3K相似，但整体位于一个独特的四螺旋束结构之上。PI3KC2家族的每个成员都含有一个长而无序的N端，其中含有网格蛋白结合基序。C端的PX-C2模块能使激酶更容易结合在含PI(4,5) P2的膜上，从而使激酶能够保持其最佳活性。对该部分的结构和生化研究表明， C2和PX中对PI(4,5)P2的选择性和亲和力较弱。但即便如此，这两个结构域排布的方向，使得两个结构域与膜的结合能够同时发生，而这至关重要，因为在这样的条件下，当激酶的核心区域与膜相互作用时，依赖于 PI(4,5)P2的高亲和力的膜相互作用就具备了发生的条件 (图1)。
图1. PIK3C2α的结构 虽然C端PX-C2模块是激酶发挥最大催化活性所必需的，但RBD与激酶结构域发生的互作，由于空间位阻，对该模块的功能会产生明显的抑制作用。将激酶结构域kα7-8 loop上的EKP 突变为KKT时，这种相互作用会受到破坏，激酶被组成性激活。因此，PI(4,5)P2与PX-C2的结合不仅能将PI3KC2α募集到膜上，还发挥了缓解自抑制的作用，这类似于磷酸酪氨酸缓解了I类PI3K催化亚基的C端SH2结构域的自抑制。位于RBD互作界面上的C2的C端可能在阻止Ras活化中发挥作用。EKP基序不直接与C2结构域结合，而是发挥稳定kα12螺旋的延伸构象的作用，从而使C2结构域拥有足够的活动性，能够RBD上的第二个结合位点结合。PX和C2结构域的释放使得膜结合的kα12螺旋定位到一个能发挥催化作用的方向上 (图1)。 PI3KC2α是目前研究得最清楚的II类PI3K，其在发育中起着至关重要的作用，由PI3KC2α产生的PI(3,4)P2是内吞的关键驱动因素。在小鼠中，C2α表达或催化活性的丧失是胚胎致死性的，这种致死性至少部分与初级纤毛信号转导的缺陷有关。中性粒周围循环区室中缺乏由PI3KC2α产生的PI3P池，会导致纤毛发生所需要的膜运输中断。此外，该酶也在初级纤毛转导剪切力刺激信号的过程中发挥不可或缺的作用，而这种剪切力刺激可以通过诱导自噬调节肾小管上皮细胞的大小。在来源于PI3KC2A纯合子功能缺失突变患者的成纤维细胞中，这种发现于纤毛的表型也有报道。临床上，这些患者存在一系列神经症状，且身材矮小，面部畸形，患先天性白内障伴继发性青光眼。虽然这些表型中的大多数与原发性纤毛功能障碍相关，但近期的研究也揭示了PI3KC2α在细胞分裂中的作用：患者中高发的白内障是由于晶状体上皮细胞的异常脱落引起衰老水平升高所致。尽管PI3KC2α在初级纤毛功能和人类发育中起着至关重要的作用，但PI3KC2A功能缺失突变的杂合子小鼠是健康和可育的，尽管在小鼠体内PI3K活性明显下降了50%。因此，靶向PI3KC2α的治疗似乎具有一定的耐受性。 对于其他PI3KC2亚型而言，目前可用的临床前数据较少。由于组织对胰岛素的敏感性增强，携带PI3KC2β激酶失活突变的纯合小鼠糖耐量增加。在肝细胞中，PI3KC2β失活使内体PI3P水平降低，同时APPL1阳性内体数量增加，导致胰岛素受体内吞受到抑制，为胰岛素敏感性的增加提供了基础。这些迹象表明，PI3KC2β可能是2型糖尿病的靶点之一。值得注意的是，这些增加对胰岛素敏感性的作用似乎独立于胰岛素受体下游经典的I类PI3K信号通路之外。PI3KC2β的失活还能通过维持内皮细胞的完整性来减少缺血再灌注损伤，而在肝细胞中，内体成熟受到抑制后，关键内皮粘附分子VE -cadherin的内吞循环可能得到增强。PI3KC2β还通过募集RhoA GAP来促进细胞迁移，因而可能在肿瘤迁移以及转移瘤的形成中发挥作用。此外，肌肉特异性敲除PI3KC2β也已被证明可以缓解与肌小管性肌病相关的PI3P水平的升高。基于以上发现，利用药物靶向PI3KC2β在各种疾病中有着广阔的应用前景。开发新型的、具有亚型选择性的抑制剂至关重要。然而，虽然PI3KC2β特异性抑制剂具有潜在的广泛应用，一些研究所展现的结果却是令人担忧的：PI3KC2B功能缺失突变会促使mTOR信号水平升高，从而在人和小鼠局灶性癫痫的发生中发挥促进作用，在这种情况下，即使迅速抑制该酶的活性也会给患者带来严重的神经系统副作用。 02II类PI3K的药理学研究 PI3KC2α是第一个被克隆的II类PI3K，其特征表现为对PI3K抑制剂wortmannin和LY294002显著不敏感。近年来，由于II类PI3K在人类健康中的重要性越来越显著，人们才开始对靶向II类PI3K给予关注。最初靶向PI3KC2的抑制剂是由I类PI3K抑制剂PIK-90衍生而来的，基于其衍生物的研究催生了4-氨基烟酰胺衍生物MIPS-19416，该药物表现出对PI3KC2α和PI3KC2β的有效性，同时对I类PI3K选择性较弱。通过高通量筛选和对药物化学特性一代又一代地优化，研究人员研发除了高选择性地PI3KC2α抑制剂 (PITCOINs)。在这些分子中，最具选择性的PITCOIN3对PI3KC2α具有非常高的敏感性和选择性。PITCON3结合PI3KC2α结构表明，PITCOIN3的N-苯基甲烷磺酰胺形成的非保守相互作用在这种选择性中发挥了重要的作用 (图2)。用PITCOIN3处理血小板时，可以观察到在PI3KC2α敲除细胞中所见的抗栓效应，提示该激酶可能作为未来抗血栓药物研发的靶点之一。
图2. PI3KC2抑制剂PITCOIN3在PI3KC2α中的结合 03II类PI3K在临床治疗中的作用 虽然PI3KC2选择性化合物研发的主要进展仅仅集中在近几年的时间中，但在遗传学上，已有相当有力的证据证实靶向该激酶的意义。在小鼠体内，诱导PI3KC2α表达量降低或使单个等位基因失去催化活性都能够发挥抗血栓生成的作用，且对凝血功能的影响较小。不论是下调PI3KC2α表达或使单个等位基因失去催化活性，血小板的基础PI3P水平均会下降，可能与质膜的膨胀和内折的增加相关。从机制上看，这可能源于spectrin、myosin、moesin等膜骨架组分附着的缺失，导致血小板边等更加坚硬，无法动脉血流的剪切力下形成稳定的血栓 (图3)。有趣的是，在抑制剂MIPS-21335的研发中，人们发现急性药物抑制可以快速并可逆地重现这些对血小板和血栓形成的影响，且在人和小鼠的血栓试验中，MIPS-21335比金标准阿司匹林和P2Y12拮抗剂更有效。
图3. 抑制PI3KC2α在抑制血栓形成和肿瘤发生中的作用 在癌症中，PI3KC2α也有作用。据报道，螺旋结构域将PI3KC2α定位到有丝分裂的纺锤体，在那里，PI3KC2α与网格蛋白 (clathrin) 以及TACC3组装以桥接着丝粒纤维。因此，癌细胞中PIK3C2A表达缺失会导致非整倍体的增加，并使癌细胞对紫杉烷疗法的敏感性增加。然而，应该注意的是，PI3KC2α在clathrin - TACC3复合物中的支架功能尚未在其他类型的细胞中观察到。PI3KC2α的催化功能在癌症中也有报道，其中螺旋结构域能将激酶定位到乳腺癌细胞的黏着斑处，产生的PI(3,4)P2刺激细胞发生恶性转变，促进肿瘤转移。有希望的是，这种增强的转移能力可以被PI3KC2α抑制剂 (PITCOIN1) 阻断。除此之外，还有迹象表明PI3KC2α在肿瘤血管生成中发挥作用。PIK3C2A内皮细胞特异性敲除由于血管生成失败而表现出胚胎致死性，与全敲的致死性表型相一致。这种表型的出现似乎是由于VE-cadherin和VEGF受体运输所必需的内体PI3P池缺陷造成的。然而，在成年小鼠中，内皮选择性PIK3C2A敲除可以抑制肺癌和黑色素瘤模型的血管生成和肿瘤生长，提示了PI3KC2α抑制剂的潜在治疗用途 (图3)。 III类PI3K: VPS34 04结构与功能调节 III类PI3K, 即VPS34 (在人类中由PIK3C3编码)，是真核生物中原始的PI3K激酶，能在体外和体内环境下催化PI生成PI3P。VPS34被发现以两种不同的四聚体复合物形式存在，分别称为复合物I和复合物II。这两种复合物都由VPS34、假激酶VPS15和含有BECLIN-1的BARA结构域组成。复合物I含有额外的组分ATG14，此外，其功能需要由第五个亚基NRBF2激活。在复合体II中含有的第四个亚基是UVRAG (图4)。这两个复合物在功能上是不同的，复合物I启动巨自噬，而复合物II则负责控制通过内吞途径的通量。
图4. VPS34结构 复合物II的晶体结构为V型， VPS34 C2结构域位于其连接处，其余部分沿着一条臂与VPS15 α-螺线管以及激酶结构域交织在一起，VPS15和VPS34的激酶结构域均位于顶端。V型结构的另一个臂由VPS15的WD40结构域组成，其两侧是来自BECLIN-1和UVRAG的卷曲螺旋结构域 (图4)，在臂的尖端形成膜结合结构域。由结构中可见，具有催化活性的激酶将通过V型结构的尖端定位到膜上，连接点从膜表面突出。复合物I的结构与复合物II大致相似，ATG14取代UVRAG，在臂的尖端形成膜结合的BATS结构域。在复合物II结构中，包括活化环在内的VPS34激酶结构域的关键元件，以与底物进入不相容的方式与VPS15相互作用。有趣的是，复合物I结构存在几种不同的构象状态，在其中的一些状态中，VPS34激酶结构域的密度不清晰，提示该部分存在动态性。这种动态性对于催化功能的发挥是必不可少的。因此，VPS15释放VPS34激酶结构域似乎是催化的必要条件。 含亚基NRBF2的复合体I的进一步结构研究提示了处于抑制状态的VPS34是如何被释放的的。NRBF2 MIT结构域的结合发生在复合物的连接处，导致VPS15 α-螺线管弯曲，取代了VPS34的激酶结构域，导致后者无法与VPS15发生抑制性的相互作用，VPS34激酶结构域向外摆动25˚。随后，第二个NRBF2 MIT结构域结合，使激酶完全活化，但活化的具体机制目前尚不清楚。此外，复合物II与早期核内体功能的主调节因子——小GTPase RAB5的相互作用已被确定 (图4)。在一个由VPS15 WGD和WD40结构域以及VPS34 C2结构域的螺旋发夹形成的口袋中，RAB5与复合物的UVRAG /BECLIN-1臂结合。与NRBF2结合复合体I类似，RAB5的结合解除了VPS15对VPS34激酶结构域的抑制作用。有趣的是，复合物I在RAB1结合时也出现了类似的结合和激活机制，揭示了一种新的巨自噬调控机制 (图5)。
图5. VPS34复合物I和复合物II被RAB1和RAB5活化 RAB5-复合物II与脂质体的相互作用存在一系列不同的角度取向，提示了复合物I和复合物II结合Rab蛋白的催化机制：BECLlN-1臂上的膜互作结构域与GTPase高变区一起，将复合物的这一部分锚定在膜表面，使得复合物能够“快速”穿过细胞膜，促进催化作用的发挥。与此同时，VPS34臂上下摆动，与膜表面相互接触并使PI磷酸化。 从VPS34精巧的结构特征中，我们可以发现这两种复合物具有本质上相同的激活机制，即通过一系列独特的相互作用将VPS34结构域从抑制性构象中释放出来。然而，VPS34结构域的催化模式和取向在每一个结构域中都表现出高度保守。ATP竞争性激酶抑制剂无法对复合物I和复合物II进行区分，选择性复合体I或复合体II的研发可能需要针对位于复合体远端区域的不同变构激活位点进行。 05III类PI3K的药理学研究 早在二十多年前，人们就已经意识到抑制VPS34的重要性。在当时，自噬抑制剂3-MA（3-methyladenine）被发现可以抑制这种酶。然而，3-MA是一种选择性极差的化合物，在抑制VPS34的同时，也会抑制其他类别的PI3K。最近，一些有效且高选择性的VPS34抑制剂已经被开发出来 (图6)。它们发挥选择性的一个共同特征是在VPS34激酶结构域的ATP结合区域，靠近P环的位置，利用了一个较大的疏水口袋。这个口袋能被VPS34-IN1和PIK-III中的环戊基、SAR405中的三氟甲基和Genentech系列中的异丙基占据，而在I类PI3K中，这些基团无法被容纳。简而言之，目前已有高效且具有选择性的化合物能够用于临川前研究，虽然这些化合物目前还无法在复合物I和复合物II之间发挥选择性。 06III类PI3K在临床治疗上的启示 VPS34复合体I在自噬中的中心作用为其吸引了广泛的关注。巨自噬维持细胞内稳态，通常被认为是健康组织中的肿瘤抑制机制。然而，肿瘤一旦形成，巨自噬对细胞存活的支持特性会反过来对肿瘤生长起到促进作用 (图6)。PIK-III、SAR405、SB02024和VPS34-IN1均抑制自噬通量，最近的临床前研究也表明，这些化合物在癌症治疗中是有效的。
图6. VPS34抑制在肿瘤治疗中的作用 展望 许多磷酸肌醇激酶与疾病相关联，包括各种血液病、神经病、传染病，以及癌症。这些磷酸肌醇激酶已被证明能够用于研发小分子抑制剂，具有巨大的治疗潜力。目前，针对大多数PI3K超家族成员以及PIKfyve，高效且具有选择性的抑制剂已被研发，这些抑制剂目前大多处于临床前研究阶段，其中一些已进入临床试验阶段。针对PI4P5K和PI5P4K以及II型PI4K，目前也已开发了初步有前景的工具化合物，按照I类PI3K研究所建立的范式，这些工具化合物的临床前和临床研究也在加速进行中。 尽管如此，一些关键的挑战依然存在。虽然I类PI3K仅由细胞外刺激活化，其他的磷酸肌醇激酶似乎需要组成性活化来发挥细胞“管家”功能。由此可见，小分子抑制剂靶向这些激酶的毒性是必定存在的，在本文中，我们已经通过PI4K和III类PI3K的例子进行了阐述。同样，一些磷酸肌醇激酶的功能缺失突变已被证实会导致人类单基因遗传病，预示着酶长期抑制的潜在后果。基于以上愿意，最有希望的靶点可能是那些对酶进行急性抑制就能产生治疗效果和且耐受性良好的疾病，如病毒感染时PIKfyve抑制剂的使用。选择性靶向真核寄生病原体的磷酸肌醇激酶似乎也有潜在的前景，因为在这种情况下可以完全避免对宿主激酶活性的影响，抗疟疾和抗隐孢子虫病PI4K抑制剂的开发就是关键的例子。 对许多种磷酸肌醇激酶的抑制都可能需要一个治疗有益的窗口期，在这个窗口期中，病理功能被破坏，同时仍然有足够的“管家”活动来维持细胞功能。尽管这无疑是一个巨大的挑战，但值得注意的是，在开发I类PI3K抑制剂时，这样的挑战也曾经存在。例如，PI3Kα抑制剂alpelisib表现出一系列靶向不良反应，但尽管如此，它已被证明对乳腺癌和PIK3CA相关过度生长综合征患者有临床益处。因此，在将磷酸肌醇激酶抑制剂应用于治疗时，将这些挑战视为不可克服的挑战是愚蠢的。I类PI3K研究的另一个经验教训是亚型选择性抑制剂在最小化不良反应方面的关键作用，这可能对本文所讨论的绝大多数激酶都是适用的。 总的来说，很明显，许多磷酸肌醇激酶是可行、潜在的非常有用的治疗靶点。未来几年的临床前和临床开发很可能会取得许多成功，也会出现不可避免的失败。然而，在对该领域的现状进行分析时，潜在的收益显然证明了，为确保临床上的获益，对基础和临床前研究进行持续的大量投资是合理的。 供稿 | 王彤彤 审稿 | 丛野 责编 | 囡囡 排版 | 可洲 |
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