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题目：The MYB transcription factor RcMYB1 plays a central role in rose anthocyanin biosynthesis 刊名：Horticulture Research 作者：Guoren He, Feng Ming et al. 单位：Shanghai Normal University, Shanghai 日期：21 April 2023    01 摘要  玫瑰（Rosa hybrida）是世界上最著名的观赏植物之一，其商品价值在很大程度上取决于其花色。然而，玫瑰花色的调控机制仍不清楚。在这项研究中，我们发现关键的 R2R3-MYB 转录因子 RcMYB1 在玫瑰花青素生物合成中起着核心作用。RcMYB1的过表达显着促进了白玫瑰花瓣和烟叶中花青素的积累。 35S ：RcMYB1 转基因品系中，花青素在叶片和叶柄中大量积累。我们进一步鉴定了两个与花青素积累相关的 MBW 复合物（RcMYB1-RcBHLH42-RcTTG1；RcMYB1-RcEGL1-RcTTG1）。酵母单杂交和荧光素酶测定表明，RcMYB1 可以激活其自身的基因启动子以及其他 EBG（早期花青素生物合成基因）和 LBG（晚期花青素生物合成基因）的基因启动子。此外，两种 MBW 复合物都增强了RcMYB1的转录活性和 LBG。有趣的是，我们的结果还表明 RcMYB1 参与类胡萝卜素和挥发性香气的代谢调节。 总之，我们发现 RcMYB1 广泛参与 ABG（花青素生物合成基因）的转录调控，表明其在调节玫瑰花青素积累中的核心作用。本研究结果为通过育种或基因改造进一步改良玫瑰花色性状提供了理论依据。 02 技术路线  The 226 wild and cultivated soybeans used for nucleotide diversity analysis 大豆、水稻、烟草、拟南芥遗传转化 RNA-seq、qPCR Phylogenetic analysis Transcriptional regulatory activity assay EMSA、ChIP-qPCR Yeast two-hybrid、BiFC Measurement of fatty acids and protein contents in soybean seeds 03 主要结果 3.1 RcMYB1编码SG6 R2R3 MYB TF 构建了拟南芥和一些蔷薇科植物中RcMYB1和MYB转录因子家族其他成员的系统发育树。在该树中，RcMYB1属于亚群6（SG6），已知其成员可促进花青素在植物中的积累（图S1）。此外，RcMYB1与玫瑰（R.rugosa）的RrMYB113、红树莓（Rubus idaeus）的RiMYB10、草莓（F.×ananassa）的FaMYB10和林地草莓（F.vesca）的FvMYB10显示出高度同源性（图S1）。多序列比对显示，RcMYB1包含典型的bHLH相互作用基序、ANDV基序和保守的R2R3 MYB DNA结合结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序（图S2）。结果表明，RcMYB1可能是玫瑰花青素生物合成的激活剂。 为了研究RcMYB1在玫瑰花瓣着色过程中的转录谱，我们选择了“Old Blush”花七个发育阶段的花瓣（S1–S7）（图1A），并测定了RcMYB1转录水平和花青素含量。RcMYB1的转录水平随着花青素的积累而逐渐增加，最高转录水平在S5，然后随着花青素的降解而逐渐降低（图1B）。因此，RcMYB1的转录谱与S1–S7期间花青素积累的趋势一致（图1C）。接下来，我们确定了RcMYB1在不同颜色的玫瑰中的转录水平，包括蓝紫色、红色、绿色、黄色和白色（图1D）。有趣的是，尽管RcMYB1在红玫瑰中显示出相对较高的转录水平，但在绿色、黄色和白色玫瑰中同样高，但在几种蓝紫色玫瑰中则较低（图1E）。黄色的花朵是由类胡萝卜素赋予的，这里研究的白玫瑰有很强的香味。因此，我们推测RcMYB1也可能参与挥发性芳香化合物和类胡萝卜素的生物合成。 为了确定RcMYB1在细胞中的功能以及它是否具有转录激活活性，我们使用酵母系统进行了亚细胞定位分析和反式作用活性测定。在亚细胞定位分析中，RcMYB1 GFP信号定位在本氏烟的细胞核中，与其作为转录因子的作用一致（图1F）。在酵母系统中，RcMYB1 BD酵母细胞和阳性对照VP16-BD在选择性培养基（SD/-Trp/-His）上也生长良好，而阴性对照（BD）不能在选择性培养液上生长（图1G）。这些结果提供了进一步的证据，证明RcMYB1在细胞核中起激活转录因子的作用。
3.2 RcMYB1促进花青素在玫瑰花瓣和烟草叶片中的积累 为了阐明RcMYB1在花青素积累中的作用，我们在R.hybrida'Gabriel’花瓣和烟草（Nicotiana tabacum）叶片中进行了短暂过表达实验。在转化后5天，对照中的白色花瓣（含有空载体，EV）显示出轻微的红色，而那些瞬时过表达RcMYB1的花瓣已变为深红色（图2A），其花青素含量显著增加（图2B），过表达RcMYB1的组也显示出ABG的转录水平显著增加（RcCHSa、RcCHSc、RcCHI、RcF3H、RcF3′H、RcDFR、RcANS、RcUFGT和RcGT1）（图2C）。 为了确定RcMYB1过表达后红色花瓣中的主要花青素成分，我们通过液相色谱-质谱法（LC-MS）检测了花青素的组成。红色主要是由于氰化物和氰化物衍生物的含量增加（图2D）。在烟草叶片中，注射35S:RcMYB1的叶片区域显示出红色并积累花青素（图2E，F）。此外，我们使用病毒诱导的基因沉默（VIGS）来沉默“Old Blush”中的RcMYB1。我们的结果表明，在RcMYB1沉默后，花瓣颜色显著变浅，花青素含量显著降低（图2G，H，I）。
3.3 玫瑰RcMYB1转基因品系花青素的显著积累 为了进一步阐明RcMYB1在玫瑰花青素生物合成中的功能，我们将RcMYB1的全长编码序列转移到pCAMBIA2300载体中，以获得35S:RcMYB1-转基因玫瑰系（OE-1和OE-2）（图3A）。通过从基因组DNA中通过聚合酶链式反应（PCR）用RcMYB1扩增pCAMBIA2300载体的部分序列，以及通过用抗GFP抗体进行蛋白质印迹来确认玫瑰转基因系（图3B，C）。在RcMYB1 OE品系中，叶、叶柄和茎显著积累花青素（图3D、E、F和图S3）。进一步的RT-qPCR分析揭示了RcMYB1和ABG的上调（图3G），与瞬时表达实验的结果一致。这些结果表明，RcMYB1广泛参与花青素生物合成的调节，以介导花青素的积累。
3.4 RcMYB1与RcTTG1和RcbHLH42或RcEGL1物理相互作用形成MBW复合物 MBW复合物在调节花青素生物合成中起着核心作用。因此，我们进一步鉴定了可能与玫瑰花青素生物合成有关的MBW复合物。利用玫瑰bHLH家族蛋白构建了系统发育树，并报道了与拟南芥花青素生物合成相关的bHLH蛋白（AtMYC1、AtEGL3、AtGL3、AtTT8）。该树显示RcbHLH42和RcEGL1与拟南芥中的这四种bHLH蛋白密切相关（图S4）。使用RcbHLH42、RcEGL1和其他已报道的与其他物种花青素生物合成相关的bHLH蛋白构建了另一个系统发育树。该树表明，RcbHLH42和RcEGL1分别与草莓中的bHLH3和bHLH33密切相关（图S5A）。多序列比对分析揭示了RcbHLH42和RcEGL1中保守的bHLH基序（图S6）。根据拟南芥AtTTG1的氨基酸序列，我们选择了与玫瑰同源性最高的WDR基因RcTTG1。用不同植物物种报道的与花青素生物合成相关的TTG1蛋白构建了系统发育树，并表明RcTTG1与草莓中的FaTTG1密切相关（图S5B）。多序列比对分析显示，RcTTG1含有保守的串联重复WD基序（图S7）。 为了进一步确定RcbHLH42、RcEGL1和RcTTG1是否与花青素生物合成有关，我们检测了它们在不同发育阶段的花中的转录水平。在花青素积累的早期阶段，RcbHLH42和RcTTG1的转录水平增加，而RcEGL1显示出下降趋势（图S5C）。然而，我们发现这三个基因的转录水平在转基因系中显著升高（图S5D）。 为了确定RcbHLH42、RcEGL1和RcTTG1在细胞中的功能，我们进行了亚细胞定位。结果显示，RcEGL1-GFP融合蛋白的GFP信号定位在本氏锥虫表皮细胞的细胞核中，而RcbHLH42-GFP和RcTTG1-GFP融合蛋白定位在细胞核和细胞质中（图S5E）。 为了确定RcMYB1是否可以与RcTTG1、RcbHLH42或RcEGL1形成MBW复合物，我们进行了酵母双杂交分析（Y2H）。定向Y2H测定验证了RcMYB1与两种bHLH蛋白（RcbHLH42和RcEGL1）和WDR蛋白RcTTG1相互作用（图4A），并且RcTTG1-也与两种b HLH蛋白相互作用（RcbHLH42或RcEGL1-）。 为了验证RcMYB1-、两种bHLH（RcbHLH42或RcEGL1）以及RcTTG_1 HAT1是否在体内相互作用，我们进行了双分子荧光互补（BiFC）测定。当RcMYB1 nYFP与RcbHLH42 cYFP或RcbEGL1 cYFP或者RcTTG1 cYFP共过滤时，以及当RcTTG1nYFP和RcbHLH42 cYFP或RcbEGL1 cYFP共过滤到本氏烟叶中时，强YFP荧光位于细胞核中（图4B）。 Co-IP分析也证实了RcMYB1和RcbHLH42或RcEGL1或RcTTG1之间以及RcTTG1和RcbHL H42或RcEGL1之间的相互作用（图这些结果表明，RcMYB12、两个bHLH（RcbHLH2和RcEGL1）和RcTTG1可以相互作用形成MBW复合物。
3.5 两种MBW复合物以功能冗余的方式正向调节花青素的积累 为了确定RcbHLHs（RcbHLH42，RcEGL1）、RcTTG1和两种MBW复合物是否参与花青素的积累，我们在烟草中进行了瞬时表达和转基因分析。RcbHLHs（RcbHLH42，RcEGL1）和RcTTG1的瞬时表达单独不促进烟炱叶片中花青素的积累（图S8A，B），而与单独瞬时表达RcMYB1的烟草相比，烟草叶片与编码两种MBW复合物的组分的基因共感染，即RcMYB 1、RcHLH42和RcTT G1（MBT）和RcMYB1，RcEGL1和RcT G1（MET）积累了更多的花青素。含有不同MBW复合物的两个品系之间的花青素积累没有显著差异（图S8A，B）。我们在玫瑰花的白色花瓣上进一步验证了这一结果。 瞬时过表达RcbHLH42和单独的RcEGL1不能促进花青素的积累（图5A，B），表达每种MBW复合物的那些比单独表达RcMYB1的品系积累更多的花青素，但两种MBW复合体品系之间的花青素含量没有显著差异（图第5A，B段）。与烟草叶片中瞬时过表达的结果相反，单独瞬时表达RcTTG1的白色花瓣显示花青素积累显著增加（图5A、B）。 进一步的分析显示，RcTTG1的瞬时过表达，而不是RcbHLH（RcbHLH42或RcEGL1），增加了ABG的转录水平（图5C）。在表达两种MBW复合物的组中，ABG的转录水平高于单独表达RcMYB1和RcTTG1的组（图5）。我们在表达两种MBW复合物的组中检测到EBG和LBG的转录水平高于单独表达RcMYB1的组。先前的研究表明，MBW复合物通常调节LBG。因此，我们假设MBW复合物可以增强RcMYB1的表达，以调节EBG的表达。 此外，在表达MBW复合物的两个系之间，ABG的表型和调节没有显著差异，表明这两个复合物在功能上是多余的。转基因烟草品系的表型也证实了我们的结果。35S:RcbHLH42和35S:RcEGL1转基因系具有与野生型（WT）相同的花色，没有显著的花青素积累（图S8C，D）。35S:RcMYB1转基因系具有更深的花色和显著的花青素积累（图S8C，D）。与瞬时表达结果不同，与WT相比，35S:RcTTG1转基因系具有更深的花色（图S8C，D）。表达MBW复合物的两个转基因品系之间的花青素积累没有显著差异，但与35S:RcMYB1和35S:RcTTG1转基因品系相比，它们都具有更深的花色，积累了更多的花青素（图S8C，D）。
3.6 RcMYB1单独或在MBW复合物中激活其自身的启动子和其他花青素生物合成基因的启动子 为了进一步研究RcMYB1在调节ABG中的作用，我们进行了Y1H和双荧光素酶报告基因（LUC）测定。当pLacZi-proRcMYB1、proRcCHSa、proRcCHSc、proRcCHI、proRcF3H、proRcF3′H、proRcDFR、proRcANS、proRcUFGT或proRcGT1融合构建体与pB42AD-RcMYB1在酵母细胞中共表达时，当在补充有X-gal的选择性培养基（SD/-Trp/-Ura）上筛选时，酵母细胞变蓝。阴性对照（BD）未能在选择性介质上变蓝（图6A）。 这些结果表明，RcMYB1不仅能够结合其自身的启动子，而且能够结合多种ABG（EBG和LBG）的启动子。接下来，我们进行了LUC实验，以确定RcMYB1和两种MBW复合物是否激活RcMYB1和ABG的启动子。结果表明，RcMYB1可以激活其自身的启动子，并且两种MBW复合物进一步增强了转录活性（图6B）。ChIP-qPCR进一步证实了RcMYB1与其自身启动子在体内的相互作用（图6C）。 此外，RcMYB1还显著激活了所有EBG和LBG的启动子。这两种MBW复合物进一步增强了LBG的启动子活性，但没有增强EBG的活性（图6B）。这些结果表明，RcMYB1可以激活其自身的启动子和多种ABG的启动子，而两种MBW复合物增强了RcMYB1-LBG的启动子活性。
3.7 RcMYB1参与类胡萝卜素和挥发性香气代谢，但不参与PA代谢 一些研究表明，MYB-TFs可以调节花青素和原花青素（PA）的积累，并在多种次级代谢途径中发挥重要的调节作用。我们发现RcMYB1在黄色花朵和芳香的白色花朵中具有高表达水平（图1D，E）。此外，我们在这些代谢途径基因启动子中发现了潜在的MYB结合位点。因此，我们研究了RcMYB1是否参与了这些代谢途径。我们的结果表明，在RcMYB1和两种MBW复合物过表达后，参与PA合成的关键酶Leucidin还原酶（LAR）或Anthin还原酶（ANR）的表达没有增加（图S9A）。 Y1H和Luc测定也表明RcMYB1不参与RcLAR和RcANR的转录调节（图S10A，B）。番茄红素β-环化酶（LCYB）和番茄红素ε-环化蛋白酶（LCYE）是类胡萝卜素合成途径中的关键分支点。有趣的是，我们发现RcLYCB、RcLYCE-1和RcLYCE-2的表达水平在RcMYB1过表达后显著增加，并通过两种MBW复合物进一步增强（图S9B）。 为了进一步研究RcMYB1与类胡萝卜素合成之间的关系，在具有浅橙色花瓣的杂交R.hybrida'Lady of Shalott’中进行了短暂过表达。结果显示，RcMYB1过表达后，花瓣显示出更深的橙红色（图7A），花瓣中类胡萝卜素和花青素的含量显著增加（图7B）。 此外，UPLC用于测定RcMYB1过表达后α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量的变化。结果表明，在杂交R.hybrida'Lady of Shalott’中RcMYB1过表达后，α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量均显著增加（图7C）。 为了进一步验证RcMYB1是否直接调节RcLYCB、RcLYCE-1和RcLYCE-2的转录，进行了Y1H、Luc和ChIP-qPCR测定。我们的结果表明，RcMYB1可以直接结合并激活RcLYCB、RcLYCE-1和RcLYCE-2的启动子（图7D、E）。ChIP-qPCR还显示，RcMYB1可以显著富集RcLYCB、RcLYCE-1和RcLYCE-2启动子上的结合位点（图7F、G、H）。
在现代玫瑰中，RhNUDX1参与了香叶醇的形成，香叶醇是主要的玫瑰香味化合物。RcEGS1负责玫瑰中丁香酚的生物合成。RcMYB1和两种MBW复合物过表达后，RcEGS1和RcNUDX1的表达也增加（图S9C）。 为了进一步研究RcMYB1是否参与芳香族化合物的代谢，对杂交R.hybrida'Gabriel’中RcMYB1的瞬时过表达进行了GC-TOFMS分析。RcMYB1过表达后，主要芳香物质苯丙烷类和单萜类的相对含量显著增加（图8A，B）。香叶醇属于单萜类化合物，由RcNUDX1合成。在我们的研究结果中，我们还发现香叶醇的相对含量显著增加（图8C）。然而，在我们的测定结果中没有发现丁香酚。Eugenol存在于苯丙素中，苯丙素通常存在于玫瑰雄蕊中，但不存在于玫瑰花瓣中。此外，进行Y1H、Luc和ChIP-qPCR测定，以确定RcMYB1是否直接调节RcNUDX1和RcEGS1。我们的结果表明，RcMYB1可以直接结合并激活RcNUDX1和RcEGS1的启动子活性（图8D，E，F，G）。
 04 结论 在这里，我们证明R2R3 MYB TF，RcMYB1，参与了玫瑰中丁香酚和香叶醇的生物合成（图8）。苯丙烷类和单萜类化合物是玫瑰的主要花类化合物。 RcMYB1过表达后，我们发现苯丙烷类和单萜类的含量显著增加，RcNUDX1催化的香叶醇含量也显著增加。我们的测定结果没有检测到由RcEGS1催化的丁香酚，可能是因为丁香酚通常存在于玫瑰的雄蕊中。 有趣的是，在RcMYB1过表达后，许多苯丙烷类和单萜类的含量显著增加，这表明RcMYB1也可能在芳香族化合物的代谢中受到广泛调节。 总之，我们发现R2R3-MYB RcMYB1在花青素生物合成中起着核心作用，也有助于类胡萝卜素和芳香挥发物的代谢。两种bHLH蛋白（RcbHLH42和RcEGL1）可以结合RcMYB1和RcTTG1形成MBW复合物，主要调节LBG来调节花青素的生物合成。 05 原文获取 原文链接： https:///10.1093/hr/uhad080 原文获取： https://www./h-nd-204.html |
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