抽象针灸经络的解剖学基础仍然是个谜。尽管与肌间/肌内筋膜或较低电阻抗的潜在相关性受到了很多关注，但过去40年进行的动物研究表明，在战略皮肤点注射示踪染料（特别是Tc-99m高锝酸盐）会产生与针灸经络密切相关的线性迁移。为了评估这种现象是否在人类中也能观察到，我们将两种荧光染料 - 荧光素钠和吲哚菁绿（ICG）注射到真皮层中，无论是在穴位（PC5，PC6和PC7）还是非穴位对照。十五名健康志愿者参加了这项研究。在PC19注射荧光素的6项试验中，15项（79%）与染料沿着与心包经络紧密匹配的路径向近端缓慢扩散有关。此外，染料在恰好穴位PC3处出现并近端聚结。在穴位PC5、PC6或PC7处注射ICG在注射部位附近显示出相似的轨迹，但在向近端迁移时发散，在穴位PC3上收敛失败。在相邻的PC6对照中注入任何一种染料都不会产生任何显着的线性途径。超声成像和静脉定位装置均未在可视化示踪通路显示任何相应的血管（动脉或静脉），但确实显示出与肌间筋膜的相关性。 1. 简介经络理论是传统中医（TCM）的基本组成部分。对于许多中医从业者来说，针灸经络不仅仅是概念结构，而是物理上真实的解剖结构。因此，自 1950 年代以来，已经进行了多次尝试，以使用现代技术证明子午线的客观存在。许多实验诉诸于寻找经络和穴位的独特生物物理特征，包括电学、声学、热学、光学、磁性、同位素和肌电特性[ 1].其他人则专注于解剖学相关性，包括原发性血管（“邦汉导管”）[2]，肌间筋膜[2]和神经血管束[3].尽管迄今为止进行了这些年的努力，但没有确凿的科学证据证明穴位或经络的存在[ 4].证实像针灸经络这样难以捉摸的东西的挑战源于这样一个事实，即针灸治疗本身的生理基础仍然不清楚[1].因此，寻找针灸解剖学不仅要确定物理解剖学相关性，还要获得有关针灸如何机械操作的生理学见解[5].到目前为止，已经出现了三个突出的假设作为潜在的候选者。6].具有里程碑意义的Langevin等人在2002年的研究报告称，近80%的穴位对应于肌间/肌内筋膜平面[7].随后，研究调查了这种相关性的生理意义，并发现有证据表明，针在松散结缔组织中旋转引起的生物力学应激/张力可以通过局部嘌呤能（腺苷）信号通路减少炎症[8,9].第二个假设围绕着穴位/经络的电特性。早在 1950 年代，点和经线就被确定为具有增加导电性、降低电阻和增加电容的局部位点 [1,10,11].此外，这些电学上不同的点与独特的组织学和功能特性有关，例如增加的间隙连接[12,13]， nNOS 表达式 [12,14]和皮下胶原带 [15].第三个假设最近引起了更多兴趣，即穴位是压力致敏增加的部位，临床病理学的存在进一步加剧了这种部位[16–19].这些点是通过将埃文斯蓝染料外渗到皮肤间质中而定位的，与针刺相邻对照相比，针刺这些穴位可显著改善临床状况[16].这三个假设在很大程度上是独立进行的，没有太多努力将单独的发现合并或整合到一个统一的过程中。确定这些机制之间的潜在联系可以提供对针灸生理效应的重要整体理解。该作用的一个潜在候选者是间质液通过结缔组织的流动[ 15].过去的研究发现，在穴位注射示踪染料会导致染料沿着与针灸经络对齐的路径线性迁移[11,20–28].观察到的迁移速度、路径轨迹以及与锝-99 （99米施4，而不是其他核染料）导致作者推测路径归因于通过细胞外基质的低液压阻力尚未描述的通道[29,30]而不是已知的血管——静脉或淋巴管[22,28].此外，这些研究在许多实验室中多次重复，尽管这些研究主要局限于动物受试者。为了重新评估这种示踪剂-染料现象，我们使用了临床级荧光造影剂——荧光素钠[ 31]和吲哚菁绿（ICG）[32]—在健康人类志愿者前臂的心包通道处。这项研究假设荧光染料在针灸穴位注射时会沿着经络通路迁移，但在相邻对照处不会。其他诊断成像技术，如超声波和红外静脉检测器，被用来详细说明可能归因于这些迁移路径的解剖结构。2. 材料和方法2.1. 参与者该研究共招募了15名健康志愿者（11名男性，4名女性）。平均年龄为37.5岁±7.5岁，范围为30至56岁。根据最近的临床医学检查确定患有任何慢性疾病的个人被排除在外。该研究获得中国临床试验注册伦理委员会批准（批准文号：<>.ChiECRCT20200040），并按照《赫尔辛基宣言》进行。在研究之前，所有受试者都获得了书面知情同意。 2.2. 荧光染料的注入和荧光观察根据国家标准化管理委员会发布的《穴位的命名和位置》（GB/T 12346-2006），由两位中医师（赵医生、胡医生）对前臂从手腕到肘部的心包经络和穴位进行鉴定。针灸点位置通过共识达成，并使用低电阻抗定位装置（针灸经络定位器WQ6F30;中国北京） [ 14,33].穴位用两个三角形贴纸划定，或用与子午线正交对齐的记号笔圈出。同时使用荧光素钠和ICG染料。在 12 名受试者中，0.1 mL 的 20% 荧光素钠（中国广西梧州药业有限公司;产品批号：181102）在左侧PC6（内关穴位）皮内注射，在5个人的子集中，随后也注射右侧PC6。特别注意确保注射剂放在皮内而不是皮下。当荧光完全消失时，一些参与者还接受了2德·或 3RD在PC6上注射。为了评估不同的荧光染料和其他PC点，在PC0（建石），PC1或PC5（大岭）中注射5.6 mL 7 mg / mL ICG（中国辽宁威彩药业有限公司）。在6名受试者中用荧光素注射液测试了位于PC6和LU6中间的PC7的相邻对照（与PC1的径向约6厘米）。 在前臂上观察到荧光素钠的荧光，激光束波长为455nm，照明功率约为0.5 mW。获得摄影图像并用500nm的长通滤光片记录，以滤除照明光。用780 nm激光激发ICG染料，并用长通滤光片大于780 nm的手机或PDE成像仪（型号C9830;滨松光子，日本）。该成像仪利用 LED 光源 （760 nm） 和 CCD 相机捕获波长大于 820 nm 的光子 [ 34].根据荧光示踪剂的迁移速率，以足以捕获染料动态进展/清除的间隔获得图像，并且长达10小时（荧光素）或超过2天（ICG）。这些图像是在关闭所有其他光源的黑暗房间中获得的。2.3. 使用静脉查找器的血管可视化为了描绘荧光染料迁移的解剖结构，静脉照明装置（投影静脉查找器V800P;深圳市怡沃光医疗器械科技有限公司）用于观察染料途径的同一位置。将荧光素示踪剂和静脉图像分别拍摄并一起进行比较。由于静脉查找器利用红外光（940 nm，而荧光素的波长为450 nm）并通过不同的可视化机制（血红蛋白吸收而不是荧光）进行操作，因此不同方法之间没有混淆成像。 2.4. 血管和荧光迹线的超声成像超声成像还用于划分与染料途径共处的解剖结构。由于荧光染料对超声成像是不可见的，因此用笔在皮肤上标记线性染料轨迹，并用细金属线覆盖，在采集的B模图像中产生狭窄的线性阴影。使用超声诊断系统（飞利浦HD15超声系统）沿金属线进行横向和纵向超声扫描。超声凝胶垫（MIBO科技有限公司，中国深圳）用于提供更好的表层皮肤层可视化和改善金属线位置的描绘。还获得了彩色多普勒以识别血管结构。 2.5. 统计分析使用适用于 Windows 的 SPSS 统计信息（版本 22.0;IBM公司，美国纽约州阿蒙克）。志愿者的年龄以平均±标准差表示。应用Fisher精确检验来比较不同条件下沿经络产生荧光轨迹的注射与总注射的比率。应用皮尔逊系数的双变量相关分析来评估年龄与结局的相关性。小于 2.0 的值（05 面）被认为是显著的。 3. 结果3.1. 荧光素钠可视化在6名研究参与者中以PC12皮内注射荧光素钠。在15项试验中的19项中，观察到线性荧光迁移在近端进行，与心包经络紧密对齐。所有 15 条示踪通路均在 1 cm 范围内，贯穿整个可视化轨迹的中医定义的心包通道。 从时间角度来看，PC6附近开始出现微弱的荧光点，注射后10至60分钟开始形成连续或折线。随着时间的流逝，它们变得越来越明显，并通过划定的穴位PC5和PC4，终止于穴位PC3（图1和2).荧光素钠染料未观察到更靠近PC3的独特途径。否则，前臂的荧光路径开始扩散并在数小时内缓慢消失。示踪剂的形成和消失速度因人而异。在一些参与者中，注射后约10分钟可以清楚地看到荧光线，荧光强度增加在1小时达到峰值;这条线将持续长达 6 小时（数字1（一）,2（a） 和2在其他志愿者中，看不到连续的线，尽管单独照亮了PC3（n = 5）。PC3处的荧光明显不同：它比PC4和PC3之间的区域更早发出荧光，明显更亮，具有圆形外观（直径大于线性路径的宽度），并且持续时间也更长，持续荧光持续长达8-10小时（图）1（二）和2（c））。  在7项试验中，将荧光素钠注射到相邻的非穴位对照（径向至PC1近6厘米），即使在观察90分钟后，前臂近端也没有发现明显的线性轨迹（图3).为了排除个人特异性影响，在其中一名志愿者中，注射了对侧手臂上的PC6，并观察到通过PC5和PC4的清晰的线性示踪剂通路，类似于在前面提到的15项PC19注射试验中的6项中观察到的。这种观察到的差异（PC6与控制点;线性路径与无路径）具有统计学意义（<0.001，费舍尔精确检验）。 在皮肤注射期间，在某些个体中也观察到荧光染料扩散到血管中。沿着静脉发现了明显的痕迹（图2（b））或不存在（图）2（f））线性染料途径。来自血管的荧光比沿PC经线迁移的染料消失得更快、更早。此外，注射后一小时，尿液变黄并部分油腻，表明大部分荧光素通过血液循环和尿液直接排出体外。在4-5小时结束时，尿液恢复到基线，没有明显看到荧光素的痕迹。 3.2. 使用 ICG 进行可视化在PC5注射ICG（图4）、PC6（图5），或 PC7（图6） - 每个参与者都在单独的参与者中。由于ICG（∼800 nm）的激发和发射波长在近红外范围内，因此与荧光素钠相比，ICG荧光能够在更深的深度（高达2 cm）下可视化[ 32,35].与荧光素钠类似，ICG在注射后6分钟至1小时的起始时间沿PC经近端产生荧光信号。与荧光素信号不同，ICG荧光路径在肘部以外（PC3近端）可见，并且明显向腋窝发展。一旦这些线在整个手臂上完全建立起来，它们就会在激发灯下用笔追踪。在大多数情况下，PC3和PC4距离迹线在1厘米以内，这表明ICG通路和PC经络之间可能存在相关性。然而，与荧光素相比，ICG荧光更具扩散性，没有产生高度明显的PC3，从PC3转移而不是直接通过它（图4和5），并且通常持续超过 48 小时。  3.3. 与染料迁移相关的因素在总共35次荧光素或ICG注射中，28次穴位注射沿PC产生22条线，而对照点7次注射未产生任何线性投影。按注射部位分列的结果见表。1. 总共有11名男性和4名女性参加了实验。与男性和女性之间预定子午线/点相关的示踪剂迁移路径的比例没有统计学差异（= 0.208，费舍尔精确检验）。年龄也与与经络相关的染料途径的比例无关（= 0.814，双变量相关分析）。 3.4. PC6相关通路的补充成像技术在穴位PC6的荧光素路径完全发育后，使用静脉照明装置评估路径是否与浅表脉管系统对齐。如图所示7，在粉红色背景上描绘为白色的静脉与以绿黄色显示的主要花序线不重叠或重合。 超声图像进一步证实了任何血管与荧光通路之间缺乏关联。由于荧光染料在超声成像中是不可见的，因此在先前观察到的荧光线上放置了一根细金属线，并且可以看到回波点，在B扫描中投射出阴影（图）8).沿金属丝纵向和横向进行超声扫描（图8).  数字8显示前臂沿荧光线横向扫描后的代表性结果。对于大部分路径，金属线位于桡侧腕屈肌和指趾屈肌浅表肌之间的筋膜上（图。8,1–3).彩色多普勒在从PC6到PC3的大部分线性病程中没有显示任何相应的脉管系统。只有在PC3附近，才有明显的多普勒信号表明示踪通路附近存在血管（图中的红色三角形8). 4. 讨论在这项研究中，将荧光素钠注射到穴位PC5，PC6和PC7与染料沿着与心包经络紧密对齐的路径向近端缓慢扩散有关。此外，染料出现并表面上准确地凝聚在PC3事先划分的位置。在穴位PC6处注射ICG在注射部位附近显示出相似的轨迹，但在近端迁移时发散，并且在穴位PC3上没有收敛。在相邻的PC6对照中注射荧光素或ICG没有产生任何显着的线性途径，至少在我们的成像采集的时间尺度上是这样。超声成像和静脉定位装置均未在可视化示踪通路中显示任何相应的血管（动脉或静脉）。 研究结果强化了过去的研究，这些研究确定了沿类似于针灸经络的线性路径缓慢迁移的示踪染料途径[ 28].例如，科瓦奇在1992年皮下注射了4种不同的核示踪剂——[99米Tc] 高锝酸钠， [201Tl]氯化铊，[131I] 碘钠和 [99米Tc] 硫化铼——进入成年犬腿部的低电阻点和相邻控制装置 [22].只有 [99米Tc]高锝酸钠注射到低电阻点产生了线性放射性途径，该途径在2厘米的距离上以大约5.11厘米/分钟的速度行进，与我们的研究规模相似。将染料直接注入血管导致更即时的外观，随后在 10 秒内轨迹消失，而 [99米Tc]硫酸铼（偏向淋巴管）在90分钟后在腋窝淋巴结和对照中均检测到，没有明显的线性通路。出于这个原因，作者得出结论，静脉或淋巴管不可能是这些轨迹的原因[22].来自中国的另一项研究同样发现，将荧光素注射到穴位中同样报告了大鼠和迷你猪沿经络的间质通道可视化[36].我们的研究在将荧光染料纳入健康人类志愿者的针灸经络研究中是独一无二的。与核示踪剂相比，荧光染料在成像分辨率方面提供了显着的改进，因为荧光成像期间发射的光子远远超过核成像中伽马辐射释放的量，其剂量被认为对人类安全。此外，荧光成像不需要重型机械或核成像所需的放射性安全预防措施，因此能够随着时间的推移对染料迁移进行更长时间和更频繁的监测。可能由于这些原因，这可能是第一次记录染料在更远端的部位注射后聚集在近端穴位 - 特别是PC3。据我们所知，这代表了经络与点之间功能性动态联系的第一个证据，其中两个针灸结构在单个测试环境中同时可视化。PC3的成像前定位（由针灸师进行）与荧光素聚集位点之间的紧密对应关系是意料之外的，并且强烈主张荧光素染料用于定位针灸特异性解剖结构的特异性。为什么用荧光素而不是ICG观察到这种观察结果仍然未知。 尽管有其优点，但荧光成像并非没有局限性。在500 nm范围内激发荧光素发射的光子容易被皮肤和底层组织吸收和散射[ 32,35].荧光素染料在更深的地方没有很好地描绘[31]并且由于这个原因，在某些可能更深层次上穿越的个体中，可能没有在肘部近端或前臂处可视化。染料在许多PC3中重新出现的事实表明，迁移途径在访问浅表位点的个体之间具有共享模式。另一方面，从激发的ICG发射的光子的波长在红外（800nm）范围内，并且不太容易被皮肤和皮下层衰减[35].因此，当ICG迁移到注射部位之外时，几乎普遍出现在前臂和上臂。虽然它与穴位注射部位附近的心包经线紧密共定位，但它似乎偏离了经络，因为它向近端迁移，偶尔分支成几个支流，而从未在穴位PC3处表现出来（与荧光素相反）。这些染料的物理化学特性可以解释这些观察到的差异。ICG 历来应用于某些临床环境，特别是用于肝肿瘤成像 [ 37]，识别胸导管 [35]，并检测前哨淋巴结 [38].已知它与白蛋白结合并进入淋巴管，在那里它可以积聚在淋巴结[32].因此，在我们的实验中观察到的ICG通路很可能描绘了淋巴管，并且在PC3上缺乏积累表明PC3与荧光素的可视化不能归因于淋巴结。相反，荧光素是一种小的亲水性分子染料，可以在间质内遵循单独的轨迹。超声图像显示，该途径与肌间筋膜紧密对齐，并且基于最近的一项研究，其中荧光素被注射到大鼠和迷你猪的低阻抗点[36]，迁移轨迹位于尚未描述的间隙通道内。过去对淋巴管的研究确定了一条单独的“组织-液体通道”，该通道穿过间质，代表了细胞外液的低水力阻力路径[39,40].可以想象，荧光素迁移途径遵循这种流体通道途径，并与针灸经络有一定的功能关系。我们研究中最后一个值得注意的观察结果是向穴位迁移途径的特异性。在非穴位注射任何一种染料仅产生局部各向同性扩散，而没有任何相关的迁移到连接的线性路径中。此外，这些点被浅表注射到皮内层中，而不会渗透到皮下深度。不知何故，在PC穴位表面注射的染料能够进入更深的迁移路径，使染料能够沿着心包通道近端迁移。此外，染料在肘部附近的PC3表面重新出现，基于荧光素的强荧光信号，已知荧光素在更深的地方显着衰减。这些结果揭示了前臂中存在连续网络的可能性，该网络由连接到浅表接入点的更深通道组成 - 就像中医经络理论中提出的一样。 总的来说，该实验的结果可能有助于整合为针灸结构的客观基础提出的各种解剖学相关性。荧光素染料采取的线性路径与前臂的肌间筋膜紧密对齐，与Langevin提出的结缔组织框架一致[ 7].只有在低电阻抗点注入染料才能形成这些线性轨迹，这不仅由本研究的结果揭示，而且从过去的动物研究[28].这种与低电阻抗穴位相关的特定功能区别与过去关于穴位电气特性的假设相符[41].最后，染料在这些独特点的聚结——埃文蓝表示超敏化点假说[16]和荧光素染料在我们的研究中 - 表明皮肤内存在局部聚集位点，这可能具有生理意义。未来的研究可能会探索这些点是否具有任何神经血管和间质收敛。这项研究有几个局限性。该研究仅限于心包通道和健康个体。这种观察到的现象的推广可能不会在其他身体部位或其他临床场景中复制。其次，本研究没有收集迁移模式的完整特征 - 例如速度，深度和相关因素（例如，水合作用，手臂抬高，血压）。此外，丰富的超几何统计分析客观地揭示了示踪剂迁移路径与针灸师确定的子午线/点之间的空间一致性，这将大大增强我们量化两条轨迹之间全长相关性的能力。最后，本研究未探讨该染料途径的生理意义以及相关的低电阻抗点。关于这个发现的网络的生理或临床意义仍然未知。未来的研究可能会更详细地探索位于穴位和经络的生理结构（如荧光素染料所描绘），以及它们与过去基础科学研究已经阐述的机制的关系 - 例如内源性阿片类药物途径。还需要定量分析荧光线与对应经络在位置和电阻抗方面的相关性。尽管如此，这项研究首次揭示了健康人类穴位和经络之间的动态功能联系，并可能开辟多种研究途径，探索针灸科学中已经提出的各种解剖/生理相关性的整合。 5. 结论在心包穴位注射荧光染料（荧光素钠和ICG）后，而不是在相邻的非穴位控制点，我们沿着该经络观察它们的荧光线。特别是荧光素钠出现并表面上准确地在PC3事先划分的位置合并。这些线不能归因于血管或淋巴管。这些发现强化了先前的研究，这些研究确定了示踪染料沿类似于子午线的线性路径的迁移途径。本研究也可能有助于整合为针灸结构的客观基础提出的各种解剖学相关性。 数据可用性用于支持本研究结果的数据可应通讯作者（Bruce Qing博士，tangqing@enn.cn). 利益冲突提交人声明他们没有利益冲突。 确认作者感谢苏焕焕女士的注射手术。赵娜女士和陆峰女士在超声成像方面的工作和有益的讨论受到赞赏。作者感谢顾飞飞女士、赵鹏娜女士和龚欢欢女士的出色技术援助。这项工作由新奥研究基金（SMKJ20190018）资助。 |
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