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一个努力中的公众号  摘要：虽然mTOR-4E-BP1信号通路与衰老和衰老相关疾病有关，但4E-BP1在调节人类干细胞稳态中的作用仍在很大程度上未知。在这里，我们报道了4E-BP1的表达随着人间充质干细胞（hMSCs）的衰老而降低。hMSCs中4E-BP1的基因失活会损害线粒体呼吸，增加线粒体活性氧（ROS）的产生，并加速细胞衰老。在机制上，4E-BP1的缺失会使线粒体呼吸复合物中的蛋白质不稳定，特别是复合物III的几个关键亚基，包括UQCRC2。4E-BP1的异位表达可以减轻4E-BP1缺陷的hMSCs和生理衰老的hMSCs的线粒体异常，减轻细胞衰老。这些发现共同表明，4E-BP1作为一种老年保护剂，可以减轻人类干细胞衰老和维持线粒体稳态，特别是线粒体呼吸复合物III，从而为对抗人类干细胞衰老提供了一个新的潜在靶点。 引言 衰老是一个渐进的退行性过程，伴随着干细胞的磨损，从而导致器官功能障碍。干细胞维持自我更新，并分化为多种类型的功能细胞，在调节组织稳态和再生中起着关键作用。组织干细胞的调节失调与多种与年龄相关的疾病有关。间充质干细胞（MSCs）是一种驻留在多个组织中的成体干细胞，可以分化成各种类型的细胞，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。MSC的衰老与多器官的衰老有关，但调控MSC衰老的分子机制尚不明确。 真核翻译起始因子4e结合蛋白1（4E-BP1）由EIF4EBP1基因编码，是雷帕霉素复合物1（mTORC1）机制靶点的关键底物和下游效应物，涉及包括衰老和癌症在内的多种生理和病理过程。4E-BP1的活性形式作为mRNA翻译的主调控因子，与真核翻译起始因子4E（eIF4E）结合，从而抑制帽依赖的翻译起始。据报道，果蝇的4E-BP1同源物在饮食限制（DR）中表达上调，通过核编码线粒体基因的翻译调控，介导DR的有益作用。然而，目前尚不清楚4E-BP1是否在调节人类干细胞的稳态或衰老中发挥了关键作用。 在本研究中，我们发现4E-BP1在复制性和生理性衰老的人MSCs（hMSCs）中的表达降低，而4E-BP1的缺失加速了hMSC的衰老。具体来说，4E-BP1的缺失增加了线粒体活性氧（ROS）水平，同时降低了线粒体呼吸能力。重新引入4E-BP1可上调线粒体氧化磷酸化复合物III核心成分UQCRC2的表达，从而部分恢复线粒体稳态，恢复衰老的hMSCs。总之，我们的研究确定了4E-BP1在维持hMSCs线粒体稳态和缓解细胞衰老方面的新作用。 实验结果 1.Depletion of 4E-BP1 accelerates hMSC senescence 4E-BP1的消耗加速了hMSC的衰老 为了检测4E-BP1的表达在人干细胞衰老过程中是否发生改变，我们通过蛋白印迹法检测年轻和衰老hMSCs中4E-BP1的水平，发现复制性衰老hMSCs中4E-BP1的水平降低（图1A）。  同样，4E-BP1在从老年人中分离出来的原代hMSCs中的表达低于从年轻个体中分离出来的表达（图1B）。  为了进一步探索4E-BP1在hMSC衰老中的作用，我们通过CRISPR/cas9基因编辑技术生成了4E-BP1缺陷（EIF4EBP1−/−）人胚胎干细胞（hESCs），并将其分化为EIF4EBP1−/−hMSCs（图1c和1D）。   通过western印迹法证实了hesc中4E-BP1的缺失(图S1A)。  通过核型分析和全基因组拷贝数变异（CNV）分析发现，EIF4EBP1−/−hESCs的基因组完整性得到了很好的维持（S1B和S1C）。   在预测的脱靶得分相对较高的基因组位点上，没有检测到脱靶切割(图S1D)。  此外，EIF4EBP1−/−hESCs保留了多能性标记物的表达，包括OCT4、SOX2和NANOG(图S1E和S1F)。  此外，4E-BP1的缺失并没有对hesc中s期细胞的百分比产生不利影响(图S1G)。 这些结果表明，4E-BP1在衰老的hMSCs中减少，但它对于维持hesc的自我更新和多能性可能是不可或缺的。 然后，我们将野生型（WT、EIF4EBP1+/+）和EIF4EBP1−/−hESCs分化为hMSCs，以评估4E-BP1缺失在hMSCs中的影响（图1C）。通过western印迹法证实了hMSCs中4E-BP1的缺失（图1E）。 流式细胞术分析显示，EIF4EBP1+/+和EIF4EBP1−/−hMSCs均表达典型的hMSC标记物，如CD73、CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13和HLA，而不表达非hMSC标记物，包括CD34、CD43、CD45、CD14、CD19、CD164和PDPN（S2A和S2B）。 与EIF4EBP1+/+ hMSCs相似，EIF4EBP1−/−hMSCs在传代早期可分化成成骨细胞和脂肪细胞（图S2C和S2D），并保持正常的形态和增殖潜能（图S2E–H）。 然而，随着传代，与EIF4EBP1+/+ hMSCs相比，EIF4EBP1−/−hMSCs的细胞增殖能力降低，表现为早发性生长阻滞、s期细胞百分比降低、克隆扩增能力受损，ki67阳性细胞减少（图1f-i）。 此外，EIF4EBP1−/−hMSCs表现出加速细胞衰老，表现为SA-β-gal阳性细胞增加和DNA损伤，ROS积累（图1j-l）。 定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析显示，在4E-BP1缺陷的hMSCs中，衰老标志物CDKN2A （P16）和CDKN1A（P21）和衰老相关分泌表型（SASP）因子IL6和IL8的表达也增加（图1M）。同时，相对于EIF4EBP1+/+ hMSCs相比，EIF4EBP1−/−的核纤层蛋白Lamin B1（LMNB1）和层相关蛋白LAP2（TMPO）水平降低（图1M），这与之前在衰老hMSCs中的研究结果一致。 此外，我们观察到将EIF4EBP1−/−hMSCs植入裸鼠胫骨前肌（TA）后，其在体内加速衰减，表明EIF4EBP1−/−hMSCs在体内的保留能力受损（图1N）。 接下来，我们对EIF4EBP1+/+和EIF4EBP1−/−hMSCs进行rna测序（RNA-seq）分析，以分析4E-BP1调控hMSC衰老的潜在机制(图1O和S2I；表S1)。 与EIF4EBP1−/−hMSCs的衰老表型一致，基因本体论（GO）分析显示，EIF4EBP1−/−hMSCs中与有丝分裂细胞周期、DNA修复和ROS反应相关的基因表达下调（图1o和1P）。 相比之下，EIF4EBP1−/−hMSCs中与细胞粘附调控、催化活性负调控、蛋白成熟负调控和衰老相关的基因增加（图1o和1P）。综上所述，这些结果表明4E-BP1缺失加速了hMSC的衰老。 2.4E-BP1 deficiency compromises mitochondrial respiration 4E-BP1缺乏会损害线粒体呼吸 线粒体功能障碍与人类干细胞衰老有关。考虑到之前报道过，4E-BP1调控线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）活性，我们假设，4E-BP1缺失引起的hMSC衰老可能至少部分是由于线粒体损伤。为此，我们进行了电镜分析，发现与EIF4EBP1+/+ hMSCs相比，EIF4EBP1−/−hMSCs在传代早期和晚期线粒体丰度增加，在传代晚期线粒体异常更多（图2a和2B）。 此外，我们发现4E-BP1消耗会损害线粒体呼吸，这可以通过基础呼吸、ATP产生、质子渗漏和最大呼吸的减少来证明（图2c和2D）。 这与先前的研究一致，表明功能失调的电子传递链可能导致ROS的积累，我们观察到EIF4EBP1−/−hMSCs中线粒体ROS和细胞H2O2水平升高（图2e-h）。 综上所述，4E-BP1在维持线粒体健康中起着重要作用。 3.Downregulation of key subunits of mitochondrial complex III in 4E-BP1-deficient hMSCs 4e-bp1缺陷的hMSCs中线粒体复合物III关键亚基下调 为了进一步揭示4e-BP1缺陷的hMSCs线粒体失调的分子机制和关键下游靶点，我们进行了定量蛋白质组学分析，以确定EIF4EBP1−/−hMSCs与WT之间蛋白水平的差异(图3A和S2J；表S2)。有趣的是，功能富集分析显示，与OXPHOS相关的蛋白在4E-BP1缺失时受到的影响最大（图3B）。 此外，氧化磷酸化途径中差异表达的蛋白大多被下调，特别是呼吸链复合物I、III和IV中的蛋白（图3c和3D）。 其中，在OXPHOS蛋白中，减少的蛋白主要出现在复合物III中，包括UQCRB、UQCRFS1、MT-CYB、UQCRC1、UQCRC2和UQCRQ（图3E），而在缺乏4E-BP1的hMSCs中，只有复合物I的两个成分（NDUFA7和NDUFS4）和复合物IV的一个成分（COX7A2L）被下调（图3E）。 Western blot分析进一步证实了EIF4EBP1−/−hMSCs中复合物III成分的减少，但没有证实其他复合物成分的减少（图3F），这与EIF4EBP1−/−hMSCs中线粒体呼吸受损和ROS产生增加的观察结果一致。 其中，免疫印迹结果显示，复合物III的多个成分，不仅是UQCRC2，还有UQCRB，以及UQCRFS1，均被下调（图3f和3G）。 综上所述，这些结果表明，4E-BP1的缺失降低了线粒体OXPHOS复合物III亚基的表达。 4.Impaired mitochondrial respiration complex III contributes to cellular senescence 线粒体呼吸复合体III受损会导致细胞衰老 为了进一步评估线粒体呼吸复合物III在调节hMSC衰老中的作用，我们使用慢病毒CRISPR/cas9介导的基因编辑技术敲除了EIF4EBP1+/+ hMSCs中线粒体呼吸复合物III的核心亚基UQCRC2。Western blot分析证实UQCRC2水平下降，UQCRFS1水平同时下调，UQCRB有下降的趋势（图4A）。随后，我们发现UQCRC2缺失导致hMSCs中线粒体稳态失调，这可以从线粒体ROS的积累中得到证明（图4B）。 此外，UQCRC2缺失诱导了hMSC衰老表型，包括sa-β-gal阳性细胞增加和集落形成能力降低（图4c和4D）。 为了进一步研究复合物III的其他成分在EIF4EMBP1−/−hMSCs中下调的潜在影响，我们在EIF4EBP1+/+ hMSCs中敲除UQCRB，观察到线粒体ROS水平升高（图4e和4F）。 同样，UQCRB缺失也增加了SA-β-gal阳性细胞，降低了集落形成能力，表明hMSCs的衰老加速（图4g和4H）。 这些数据表明，线粒体OXPHOS复合物III核心成分的破坏使hMSCs的线粒体受损，诱导细胞衰老。 5.4E-BP1 stabilizes a core component of OXPHOS complex III, UQCRC2 4E-BP1稳定OXPHOS复合物III的核心成分UQCRC2 为了了解4E-BP1如何调控OXPHOS复合物III亚基的表达，包括UQCRC2、UQCRB和UQCRFS1，我们在转录和翻译水平上询问了它们的变化。在转录水平上，我们通过RNA-seq和qRT-PCR分析检测到EIF4EBP1+/+和EIF4EBP1−/−hMSCs之间UQCRC2、UQCRB和UQCRFS1的mRNA水平无显著差异（图5a和5B）。 在翻译水平上，我们进行了多聚体分析，以测量EIF4EBP1+/+和EIF4EBP1−/−hMSCs中UQCRC2、UQCRB和UQCRFS1的翻译状态（图5c和5D）。虽然4E-BP1已被报道为某些具有特殊结构的mrna中的翻译抑制因子，在这里，我们发现，在hMSCs中，UQCRC2的翻译效率不受4E-BP1缺失的影响（图5D）。相反，在4E-BP1缺失后，可以观察到UQCRB的翻译增加和UQCRFS1的翻译略有增加的趋势（图5D）。这些结果并不能解释4e-bp1缺陷的hMSCs中UQCRB和UQCRFS1蛋白水平的降低。鉴于4E-BP1可以调节p21蛋白的稳定性，然后，我们研究了它是否调节了hMSCs中OXPHOS复合物III蛋白的稳定性。 事实上，我们首先通过共免疫共沉淀（co-IP）检测确定了4E-BP1和UQCRC2之间的潜在相互作用（图5E）。此外，免疫荧光染色显示，部分4E-BP1信号与COX IV共定位，这是一种线粒体内膜蛋白，也属于线粒体OXPHOS（图5F）。 此外，我们发现，与EIF4EBP1+/+ hMSCs相比，环己胺（CHX）处理EIF4EBP1−/−hMSCs后UQCRC2的降解加速（图5G），这意味着4E-BP1在UQCRC2的稳定中发挥了作用。此外，我们还观察到，在EIF4EBP1−/−hMSCs中，UQCRFS1的蛋白稳定性同时出现下降，而UQCRB的蛋白稳定性也呈下降趋势（图5G）。 综上所述，这些结果表明，4E-BP1可能部分通过稳定线粒体OXPHOS复合物III核心成分来调节线粒体稳态。 6.Overexpression of 4E-BP1 rescues mitochondrial homeostasis and alleviates hMSC senescence 过表达4E-BP1可挽救线粒体稳态，缓解hMSC衰老 为了进一步评估4E-BP1通过调节hMSCs中线粒体稳态的潜在老年保护作用，我们使用表达4E-BP1的慢病毒载体将4E-BP1重新导入EIF4EBP1−/−hMSCs中（图6A）。4E-BP1的重新表达不仅增加了UQCRC2的蛋白水平（图6B），而且部分挽救了EIF4EBP1−/−hMSCs的线粒体功能，从线粒体ROS水平降低可知（图6C）。 此外，4E-BP1的重新表达减轻了hMSC的衰老，表现为SA-β-gal阳性细胞数量减少，集落形成能力增强（图6d和6E）。
考虑到4E-BP1在从老年个体中分离出来的原代hMSCs中表达下调（图1B），我们检测了过表达4E-BP1的细胞是否能使生理上衰老的人类干细胞恢复活力（图6A）。事实上，4E-BP1过表达增加了生理上衰老的hMSCs中UQCRC2的蛋白水平（图6F）。 此外，4E-BP1过表达降低了线粒体ROS水平，减弱了衰老表型，表现为衰老原代hMSCs中sa-β-gal阳性细胞数量减少，集落形成能力增强（图6g-i）。 综上所述，这些发现表明，4E-BP1至少部分通过提高线粒体OXPHOS复合物III核心成分UQCRC2的表达水平，在hMSCs中发挥了老年保护作用，并恢复线粒体功能(图S2K)。 讨论 在本研究中，我们发现4E-BP1通过促进线粒体健康在hMSCs中发挥了衰老保护作用。首先，我们观察到4E-BP1在复制性和生理性衰老的hMSCs中的表达下调，而4E-BP1的缺失加速了hMSCs的衰老。此外，我们发现4E-BP1部分定位于线粒体内，通过稳定线粒体OXPHOS复合物III成分UQCRC2来维持线粒体稳态是不可缺少的。重要的是，过表达4E-BP1增加了UQCRC2的蛋白水平，从而提高了线粒体的适应度，缓解了hMSC的衰老。因此，据我们所知，我们的研究结果表明，4E-BP1至少部分通过调节线粒体稳态，在缓解人类干细胞衰老方面发挥了新的作用。 虽然先前的研究结果表明4E-BP1与衰老有关，但这些研究大多数都是在模型生物中进行的，包括果蝇和啮齿动物。在果蝇的肌肉中，构成型活性4E-BP的过表达延长了它们的中位寿命和最大寿命。同样，4E-BP1在雄性小鼠中的转基因表达减轻了代谢紊乱和衰老诱导的肥胖（Tsai et al.，2016a），而4E-BP1和4E-BP2的缺失加速了小鼠胚胎成纤维细胞的衰老。在这里，我们通过基于CRISPR/cas9的策略生成了4E-BP1缺陷的人干细胞，并揭示了4E-BP1在hMSCs中的老年保护功能。我们的发现和之前的报告表明，4E-BP1在对抗衰老/衰老方面发挥了关键作用，而衰老是从模式生物（如果蝇和啮齿动物）到人类干细胞的进化保守的，因此为临床转化提供了有前途的潜力，特别是在对衰老和年龄相关疾病的干预方面。 线粒体功能障碍被认为是干细胞衰老的标志物和诱导物。线粒体通过呼吸过程为细胞的代谢和生长提供必要的能量和底物。然而，线粒体异常导致能量供应减少，ROS释放增加，从而导致线粒体稳态被破坏，诱导细胞衰老。先前的研究表明，果蝇中的4E-BP1同源物通过调节核编码的线粒体基因的翻译，正向介导线粒体活性，这意味着4E-BP1可以间接调节线粒体活性。在本研究中，我们确定了4E-BP1在维持线粒体稳态中的关键作用，因为敲除4E-BP1会导致hMSCs中的线粒体异常、能量代谢紊乱和ROS积累。与报道的4E-BP1通过翻译调控调节线粒体活性的功能不同，我们发现4E-BP1与OXPHOS复合物III组分UQCRC2相互作用并稳定，从而挽救线粒体健康，抵抗hMSC衰老。因此，我们的研究为4E-BP1调控线粒体能量代谢提供了一个更直接的模型，有助于揭示人类干细胞衰老过程中mTOR通路相关的营养意识与线粒体介导的能量代谢之间潜在的关联。虽然先前的研究暗示了UQCRC2可能通过线粒体自噬或泛素-蛋白酶体途径降解，，4E-BP1在这一过程中的作用仍有待进一步研究。 UQCRC2作为线粒体呼吸复合物III的核心亚基，在复合物III的组装中是不可或缺的。UQCRC2的突变严重降低了复合物III的水平，这反过来又有助于细胞稳态受损，如抑制内皮细胞的增殖。一致地，我们发现UQCRC2敲低也导致hMSCs的增殖受损并加速衰老，这与在4e-bp1缺陷细胞中观察到的表型相似。此外，我们检测到在UQCRC2耗尽后，复合物III中其他成分（如UQCRFS1）的水平降低。先前的研究报道了线粒体呼吸链酶在一个超级复合体中相互依赖地关联，而单个成分的缺陷通常会导致整个复合体的损伤，这也支持了我们的发现。 值得注意的是，与我们在hMSCs中观察到的不同，4E-BP1缺失并没有对hESCs的基因组稳定性、自我更新和多能性产生不利影响，这表明hESCs中具有更精细的具有细胞类型特异性的稳态调节系统。hescs是否可以利用其他不同的线粒体适应度维持机制仍有待研究。这些发现进一步提出了一个问题，即翻译和能量代谢机制如何协调，以精细调节不同类型的人类干细胞的稳态。 综上所述，我们发现了4E-BP1作为线粒体稳态的稳定剂和拮抗hMSC衰老的老年保护剂的新功能。重要的是，我们报道了一种以前未被描述的机制，即4E-BP1通过稳定线粒体OXPHOS复合物III的核心成分来维持线粒体稳态并发挥功能。这些发现为4E-BP1在调节人类干细胞衰老中的作用提供了新的见解，并通过调节线粒体健康为抗衰老和衰老相关疾病的潜在靶点。 生词学习积累 Implicated adj. 密切关联的；牵涉其中的 human mesenchymal stem cells (hMSCs) 人间充质干细胞（hMSCs） Genetic inactivation [医]遗传失活，遗传灭活 Compromise n. 折中；妥协方案；达成协议 v. 妥协；违背；使陷入危险 reactive oxygen species (ROS) 活性氧（ROS） accelerates cellular senescence 加速细胞衰老 Mechanistically 机制上 Destabilize vt. 使打破平衡，使不稳定；使动摇 Ectopic expression 异位表达 Attenuate vt.& vi. （使）变细；（使）变薄；（使）变小；减弱 Alleviate v. 减轻；缓解 Physiologically 生理上的 Mitigate vt. 使缓和，使减轻；使平息vi. 减轻，缓和下来 Counteract v. 抵制；抵消；抵抗 Attrition n. 消耗；消磨；摩擦；（神学）不彻底的忏悔 Osteoblast n. 成骨细胞；造骨细胞 Chondrocyte 软骨细胞 Elusive adj. 难以捉摸的；不易记住的；逃避的；难以找到的 Eukaryotic adj. 真核的 4E-binding protein 1 (4E-BP1) Substrate n. 底物；底层；基底；基层 rapamycin complex 1 (mTORC1) 雷帕霉素复合物1（mTORC1） Physiological adj. 生理学的；生理的 Pathological adj. [医]病理学的；由疾病引起的；病态的，疾病的 eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) 真核翻译起始因子4E（eIF4E） Drosophila [医]果蝇属 dietary restriction (DR) 饮食限制（DR） replicatively and physiologically senescent 复制性衰老和生理学衰老 lamina protein Lamin B1 (LMNB1) 层粘连蛋白 decay v. （使）腐烂，腐朽；衰败n. 腐烂，腐朽；衰败 tibialis anterior (TA) 胫骨前肌（TA） Retention n. 保留；记忆力，保持力；滞留，扣留；闭尿 Mitotic adj. 有丝分裂的 |
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