猴痘是一种罕见的人畜共患性疾病，由猴痘病毒引起。猴痘病毒是一种双链DNA病毒，与天花病毒均系痘病毒科正痘病毒，一般通过与受感染的人或动物或被病毒污染的物品密切接触等途径传播。人类猴痘临床表现与天花相似，可引起类似于天花的皮疹、发热、寒战和肌肉酸痛等临床症状[1]，病死率为3%～6%。其中儿童、年轻人和免疫缺陷个体的死亡率相对较高，当猴痘并发败血症、脑膜炎、骨髓炎等症时，死亡率高达10%[2]。已有抗病毒药物及疫苗被批准用于猴痘的治疗与预防。但治疗及预防效果仍处于研究阶段。

猴痘之前多见于中非和西非雨林附近，目前有扩散流行的趋势。2022年6月1日，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）表示，全球30个非猴痘流行国家和地区已报告550多例猴痘确诊病例。2022年7月23日，WHO再次拉响警报，宣布将猴痘疫情列为国际关注的突发公共卫生事件（Public Health Emergency of International Concern，PHEIC），上次发布全球卫生紧急事件是在2020年1月，以应对新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情。这是截至目前以来WHO宣布的第7次PHEIC，也是WHO能够给出的最高预警级别。目前猴痘尚无特效治疗方法，主要采用对症支持治疗。虽然天花疫苗对猴痘有一定的治疗作用，但天花疫苗在世界上使用并不普遍，人群普遍缺乏对天花病毒的免疫力。鉴于中医药的免疫调节和抗病毒作用，本研究拟探讨中医药治疗猴痘的可能性。

仙方活命饮由金银花、防风、白芷、当归、陈皮、甘草、赤芍、浙贝母、天花粉、乳香、没药、穿山甲、皂角刺组成，具有清热解毒、散结消肿、祛痘止痛的作用。药理实验证明，其组成药物具有抑菌、消炎、镇痛等作用[3-4]。仙方活命饮在临床上被广泛应用于治疗脓肿、痤疮、疖、皮疹、皮炎等疮疡性皮肤病[5-6]以及糖尿病足、盆腔炎、肛周脓肿等感染性炎症疾病[7-9]，被称为“疮疡之圣药，外科之首方”，通治一切阳证疮疡肿毒。

在国家卫生健康委办公厅与国家中医药管理局办公室出台的《猴痘诊疗指南（2022年版）》中，其临床表现多见寒战、发热、皮疹与其他中医常见的阳证疮疡症状，且中医治疗推荐方以紫雪散、升麻鳖甲汤、升麻葛根汤等一系列用于治疗阳证疮疡之方为主[10]。因此，仙方活命饮在治疗猴痘，尤其是皮疹预后恢复和预防病毒外溢方面具有巨大潜力。但仙方活命饮治疗疾病的潜在机制尚未被完全了解，其对猴痘的治疗效果尚无报道。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点（nodes）进行多靶点药物分子设计的新学科。其强调对信号通路的多途径调节以及多成分-多靶点-多途径的调节，从分子学与生物学角度将中药中有效成分与靶点基因相联系。分子对接技术是通过计算机直接分析受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法，主要研究分子间（如配体和受体）相互作用，并预测其结合模式和亲和力的一种理论模拟方法。

近年来，分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术[11]。而分子动力学则是对于原子核和电子所构成的多体系统，用计算机模拟原子核的运动过程，从而计算系统的结构和性质的方法[12]，其作为一种较为优秀的研究方法，被广泛应用于材料学、化学、生物学等领域。在药学领域，分子动力学常被用于药动学研究，以进行新药开发的筛选与预测。本研究采用网络药理学和分子动力学方法探讨仙方活命饮治疗猴痘的可能分子机制，以期为猴痘的治疗方案与相关治疗药物的开发提供科学依据。

1 仙方活命饮活性成分筛选

以OB≥30%、DL≥0.18作为阈值，筛选仙方活命饮中的化合物，其中浙贝母10个、皂角刺10个、天花粉2个、乳香6个、没药34个、金银花17个、甘草88个、防风18个、当归2个、赤芍14个、陈皮5个、白芷20个。将其合并，去除重复项后，共得到191个化合物，将其作为仙方活命饮的活性成分。

2 仙方活命饮靶点预测

使用TCMSP数据库得到仙方活命饮的药物组分的预测靶点后去重，共得到296个靶点蛋白。使用Uniport数据库进行蛋白名称与基因名称的转换，经去重后，共得到248个相关基因，作为仙方活命饮有效成分对人体的作用靶点。

3 猴痘靶点预测

根据|log2FC|≥0.5且P＜0.05的阈值，获得321个猴痘差异基因。其中只有5个是上调的，其余的差异基因均为下调。以渐变火山图展示基因的分布情况，排名前10位的差异基因被标识在图中（图1）。

将猴痘的差异基因与仙方活命饮的靶点基因取交集，得到的共同的靶点基因进行相关生物信息学分析。

4 仙方活命饮-猴痘共同靶点分析

将仙方活命饮靶点基因与猴痘差异基因取交集，共得到9个交集靶点，包括前列腺素过氧化物内合酶1（
prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1）、花生四烯5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、组织蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）、螺旋环螺旋结构域扩散激酶（component of inhibitor of nuclear factor kappa B kinase complex，CHUK）、NFE2样BZIP转录因子2（NFE2 like BZIP transcription factor 2，NFE2L2）、RUNX1伴转录共抑制因子1（RUNX1 partner transcriptional co-repressor 1，RUNX1T1）、白三烯A4水解酶（leukotriene A4 hydrolase，LTA4H）、激酶插入区受体（kinase insert domain receptor，KDR），认为是仙方活命饮作用于猴痘的有效靶点。

5 PPI网络分析

将数据上传STRING数据库后，得到1个包含6个点、7条边的PPI网络，平均节点度（average node degree）值为1.56，见图2。

6 GO和KEGG富集分析

为了阐明仙方活命饮治疗猴痘的潜在机制与生物通路，本研究进行了GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。

GO分析结果显示，共获得了502个条目，包括446个生物过程条目、9个细胞成分条目与47个分子功能条目。其中，生物过程包括类二十烷素生物合成（GO：0046456）、血管生成调控（GO：0045765）、血管发育调节（GO：1901342）等。细胞成分包括核基质（GO：0016363）、富含纤维胶凝蛋白的颗粒内腔（GO：1904813）、核外围（GO：0034399）等。分子功能包括氧化还原酶活性，作用于单个供体与分子氧合并，合并2个氧原子（GO：0016702）；氧化还原酶活性，作用于单一供体与分子氧掺入（GO：0016701）；白三烯A4水解酶活性（GO：0004463）等，见图3。

KEGG分析结果显示，共有73条具有统计学意义的相关通路，前3位分别为花生四烯酸代谢（ko00590）、急性髓性白血病（ko05221）、弓形虫病（ko05145），见图4。由此不难得出，仙方活命饮是通过多靶点、多途径在猴痘的治疗中发挥重要作用，且主要作用方式是抗炎和抗感染。

7 分子对接结果

将小分子配体与蛋白质受体进行下载、修饰，转化为pdbqt后，共得到103个小分子配体（仙方活命饮活性成分）与9个蛋白质受体，分别是PTGS1（PDB ID：6Y3C）、ALOX5（PDB ID：3V98）、PPARG（PDB ID：6MS7）、CTSD（PDB ID：6QCB）、CHUK（PDB ID：3BRT）、NFE2L2（PDB ID：2FLU）、RUNX1T1（PDB ID：1WQ6）、LTA4H（PDB ID：3U9W）、KDR（PDB ID：2XIR）。将小分子配体与蛋白质受体分别进行对接，共形成927种组合，最终对接成功520种蛋白质受体-小分子配体组合。

在实践中，经常使用结合能来评估受体与配体的亲和力程度。一般认为，结合能小于−4.25、−5.0或−7.0 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ）分别表明受体与配体之间具有一定、良好或强的结合活性。结合能反映了受体与配体结合的可能性。结合能越低，受体与配体的亲和力越高，构象越稳定。

本研究结果显示，结合能≤−4.25 kcal/mol的有409个，≤−5.0 kcal/mol的有399个，≤−7.0 kcal/mol的受体-配体组合有179个，表明大多数受体-配体之间均能较好结合发挥作用。结合能排名前10位的受体-配体复合物为PTGS1-甘草异黄烷酮、PTGS1-3′-甲氧基光甘草定、PTGS1-shinpterocarpin、PTGS1-4'-甲氧基光甘草定、PPARG-豆甾醇、PTGS1-甘草苷、PPARG-光甘草定、PPARG-shinpterocarpin、PTGS1-光甘草定、PPARG-β-谷甾醇。结合能见表1。在这10种受体-配体组合中，受体为PTGS1和PPARG，说明在猴痘的治疗过程中PTGS1与PPARG发挥主要作用。对接结合能排名前4位的受体均为PTGS1，且结合能小于−12 kcal/mol，说明PTGS1能够与小分子配体形成较为稳定的构象（图5），从而发挥作用。

8 分子动力学结果

8.1 均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）

分子动力学模拟的RMSD可反映受体-配体复合物的运动过程，复合物的RMSD越大，波动越剧烈，则不稳定性越高；相反则复合物体系越稳定。其中，PTGS1-3ʹ-甲氧基光甘草定、PTGS1-shinpterocarpin、PTGS1-4ʹ-甲氧基光甘草定3个复合物体系的RMSD在模拟的前5 ns逐渐收敛，并在随后的模拟中保持较为稳定的波动。PTGS1-甘草异黄烷酮的RMSD在15 ns后也保持较为稳定的波动，表明4种复合物体系的运动在结合之后得到稳定。

相比之下PTGS1-甘草异黄烷酮的RMSD最高，然后依次是PTGS1-shinpterocarpin、PTGS1-4'-甲氧基光甘草定、PTGS1-3'-甲氧基光甘草定。说明这些复合物体系的稳定性由高到低依次为PTGS1-3'-甲氧基光甘草定＞PTGS1-4'-甲氧基光甘草定＞PTGS1-shinpterocarpin＞PTGS1-甘草异黄烷酮。结果表明，这4种小分子均能与PTGS1结合并保持相对稳定的状态，计算结果见图6。

8.2 结合自由能

基于分子动力学模拟的轨迹，使用MMPBSA方法计算结合自由能，这可以更准确地反映靶蛋白与小分子（受体-配体）的结合方式。负值表示小分子与靶蛋白具有结合亲和力，值越低表示结合力越强。计算结果表明，这些小分子与相应的蛋白质具有一定的结合亲和力，而且非常强。其中PTGS1-shinpterocarpin的结合亲和力最高，为（−103.463±1.371）kJ/mol（表2）。

8.3 氢键分析

氢键是最强的非共价结合相互作用之一。氢键数量越多，则证明结合效果越好。结果表明，受体-配体的氢键数量由多到少依次是PTGS1-3'-甲氧基光甘草定＞PTGS1-4'-甲氧基光甘草定＞PTGS1-甘草异黄烷酮＞PTGS1-shinpterocarpin。由图7中所呈现的氢键数量可推测PTGS1-3'-甲氧基光甘草定、PTGS1-4'-甲氧基光甘草定、PTGS1-甘草异黄烷酮的相互作用可能是以氢键为主。PTGS1-shinpterocarpin的相互作用可能不是通过氢键，而是通过疏水作用发生的。

8.4 目标蛋白在残基水平上的稳定性

为了探索大分子蛋白在残基水平上的局部波动，引入均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF），用以反映蛋白质在分子动力学模拟过程中的灵活性。通常药物与蛋白质结合后，蛋白质的柔性降低，从而达到稳定蛋白质的作用，发挥酶促作用。结果表明，4种复合物的RMSF峰值与谷值位置基本相同，表明4种药物起效部位近似，可能是通过类似的机制发挥功效的。RMSF计算结果见图8。

8.5 回转半径（radius of gyration，ROG）分析

ROG反映了受体-配体结合的紧密性，并能反映结合体系的约束程度。4个受体-配体复合物ROG平均值均为2.5，表明系统的密度较高，结合紧密。计算结果见图9。

8.6 溶剂可及表面积分析

溶剂可及表面积按照被溶剂包围的界面来计算。溶剂在不同条件下表现出不同的行为，因此溶剂可及表面积是研究溶剂环境中蛋白质构象动力学的有用参数。4种复合物接触溶剂面积相近，小分子物质对蛋白靶点的作用受溶剂的影响较小。结果见图10。

讨论

天花是由天花病毒感染引起的，具有高传播性与死亡率的疾病，在集中接种疫苗后，天花已被消灭。猴痘是一种源于非洲的人畜共患疾病，与天花临床表现相似。在1980年宣告消灭天花后，猴痘逐渐成为影响公共卫生最重要的正痘病毒感染疾病。目前，多个非猴痘流行国家和地区相继报道了猴痘病例，且呈现上升态势。一旦猴痘出现大范围传播，可能造成新一轮的全球“疫情”。与其他病毒感染一样，猴痘也可以引起人体的炎症因子风暴和脓毒症，而现在尚无针对猴痘的特异性治疗药物或疫苗。

有研究发现，在感染猴痘24 h后开始使用抗病毒药物治疗，可显著降低死亡率并减低猴痘所造成的皮肤损伤，从一定程度上证明了抗病毒疗法对猴痘的治疗潜力[23]。目前研究发现，特考韦瑞与布林西多福韦均显示出对双链DNA病毒（包括痘病毒）的抗病毒活性[24]。但因病毒易突变的特点，针对病毒的特效药常常在使用一段时间后产生耐药性。因此，寻找合适的药物预防与治疗猴痘的前瞻性研究迫在眉睫。且研究显示，对于猴痘病毒而言，抗病毒治疗或许比接种疫苗能够起到更好的效果[23]。

中医药因其多靶点作用以及较为安全的特点，近年来逐渐被人们关注。仙方活命饮是中国传统医学的经典方剂，其具有多种药物组分，常用于疱疹、脓肿合并发热的治疗，具有多靶点协同治疗及毒性低的优势。实验证实仙方活命饮中的组成药物金银花、白芷、皂角刺、浙贝母等提取物及其含有的单体成分在体外具有一定的抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒作用[25-32]，而这也是治疗猴痘的可能机制。由于猴痘病毒的不易获取，加之其临床病例较少，故本研究通过网络药理学与多数据库协作，探讨了仙方活命饮治疗猴痘的潜在治疗靶点，预测了相关药理作用机制，并使用分子对接与分子动力学的方法来确定了活性化合物-靶点蛋白所形成构象的稳定性，为未来的临床治疗与研究提供了新的思路。

通过PPI与分子对接分析筛选可知仙方活命饮主要通过ALOX5、PPARG、CTSD、PTGS1、CHUK、NFE2L2、RUNX1T1、LTA4H、KDR等靶点发挥抗猴痘病毒的作用。这些蛋白从不同角度，发挥着抗炎、抑菌、止痛的效果，尤其是这其中的PTGS1与PPARG。

环氧合酶（cyclooxygenase，COX）是体内催化花生四烯酸合成的关键酶，属于膜结合蛋白，主要存在于哺乳动物的微粒体中，是非甾体类抗炎药物的作用靶点。在哺乳动物细胞中，COX表达为2个亚型，分别为COX-1与COX-2，分别由PTGS1与PTGS2基因编码。其中COX-1与正常细胞的前列腺素家族合成有关，参与正常的生理活动，维持体内的炎症水平。其不仅是要素酶，更是诱导酶，参与炎症活动，具有加重炎症的作用。COX-1可催化花生四烯酸转化为前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2），PGH2是多种细胞特异性前列腺素和血栓素合酶的直接底物[33]。

除此之外，COX-1尚具有促使血小板聚集的作用，先前的研究发现，血小板定位的COX-1合成血栓素的前体，而血栓素则是一种有效的血小板聚集诱导剂。缺乏COX-1的血小板不能产生合成血栓素的前体，因此表现出聚集的延迟。实验表明，将鼠的PTGS1基因敲除后，鼠的COX-1合成减少，且它们的花生四烯酸相关的炎症反应降低，这从另一个角度证明PTGS1具有生成COX-1从而调节炎症水平的作用[34]。在生物体中，PTGS2基因编码COX-2蛋白，与炎症相关。

COX-2是催化花生四烯酸产生前列腺素的关键限速酶之一，当细胞受到各种刺激因素包括生长因子、细胞因子、炎性介质等作用时，COX-2的表达迅速上调。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是COX-2催化花生四烯酸生成的主要产物。由此推测，仙方活命饮治疗猴痘的机制类似于非甾体类抗炎药物，即通过作用于COX家族，调节前列腺素的分泌进而调节炎症反应来进行治疗。

PPAR是一类配体激活的核转录因子超家族成员。主要包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ（即PPARG）3种表型，其中以PPARγ的研究最为深入。PPARγ在炎症、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和糖代谢、肿瘤和肥胖中起到重要的调节作用。在炎症反应中，γ-干扰素（interferon-γ，INF-γ）与PPARγ相关信号密切相关。据报道，IFN-γ刺激后可诱导并活化Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路，使肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）分泌增多[35]。在大鼠巨噬细胞和人结直肠腺癌上皮细胞细胞中，IFN-γ可通过激活JAK2和下游的STAT1和STAT3，增强诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达并加重炎症反应。

Li等[36]研究表明，与配体结合的PPARγ可以抑制IFN-γ/脂多糖介导的iNOS合成，从而发挥抗炎效应。除此之外，PPARγ可以直接与核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的亚基结合，形成转录抑制复合物，降低了NF-κB与DNA结合活性，抑制NF-κB合成。PPARγ还可以通过与竞争结合协同转录辅激活子p300/CBP来抑制NF-κB的转录。在大鼠结肠炎的模型中，应用PPARγ激动剂，可以观察到大鼠组织中COX-2、PGE2、TNF-α等炎症因子表达显著减少，证实了上述说法[37]。

本研究仍有一些局限性。当前的网络信息技术有待进一步完善，数据库数据的准确性和及时性有待科学验证。同时，数据库中未记载或未经验证的化合物本研究未纳入分析。本研究筛选出的主要活性成分并不能完全代表仙方活命饮，因此需要考虑药效学实验和分子生物学实验来进一步验证本研究结果。由于这些潜在活性成分对猴痘病毒的作用及机制尚未得到阐释和验证，因此该研究具有很大的发展空间和研究意义。

本研究结果显示，仙方活命饮治疗猴痘具有多成分、多靶点、多通路、联系复杂的特点，特别是通过GO和KEGG富集分析发现，仙方活命饮对猴痘具有多种协同治疗作用。后续可对仙方活命饮中各成分相互作用、配伍变化及不同含量对猴痘病毒的影响进行实验验证，为相关药物的开发提供方向。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：孙资金，张风君，吉 静，徐 甜，程发峰，刘 媛，张 林，彭 敏，赵 琼．基于生物信息学与分子动力学的仙方活命饮治疗猴痘作用机制与分子靶点预测 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2197-2207.