|
Western blot免疫印迹（以下简称WB）实验作为检测蛋白表达相对定量的技术，在完成Western blot实验后，得到的是蛋白条带，还需要再对Western blot条带进行结果处理。对于WB结果处理的过程，主要分为3个部分: 1. 用PS软件进行排版； 2. 用image J进行灰度值分析； 3. 用prism软件进行作图分析。 一、 用PS对WB图片排版 1. 打开PS软件，如下图需要处理β-actin蛋白和Xprotein蛋白，将WB灰度图一起拉到PS中 ： 
2. 有一些条带会出现倾斜的情况，会影响美观，因此我们需要将条带拉直至在在同一水平线上。选择【标尺工具】，对着WB条带的首尾画一条直线，接着点击【拉直图层】，图片即可呈现水平状态。  拉直后的wb条带图  拉直后的wb条带图 3. 在不改变台条带趋势的情况下，可以对条带进行曝光度调整（图像-调整-曝光度）； 
4. 新建画布，点击文件-新建画布即可新建。新建大小可以根据PS的默认大小来新建，也可以自己自定义画布大小。 
5. 点击【矩形选择框工具】-选中条带，点击【移动工具】，点击选中的条带，将条带拖至新建的画布中（或者复制选中的条带后，再到新建画布中粘贴也可以）。 
6. 同样的方法，我们可以将第二个条带或第三个条带拖新建的画布中，快捷方式ctrl+t可以调整图片大小，拖动图片使图片条带对齐即可。下图的图层1和图层2对应的是拉进来的2个蛋白图。 
7. 描边。选择对应的蛋白条带图后，点击编辑-描边，这里选择1像素，选择太高像素边框会加粗。 
8. 最后标注就可以了。点击文字工具，可以选择选择横排文具工具或者竖排文字工具，选择合适的字体大小，再在需要标注的单击即可进行文字编辑。 
9. 调整图片大小，保存图片。如图画布太大，可以通过裁剪工具裁掉一部分的画布，最后通过“文件“-”储存为“，选择对应的图片格式保存图片。 
二、 灰度值分析 1. 打开image J软件，打开以上排版好的WB图； 2. 转为灰度图片：点击image- type-8 bit 3. 设计参数：点击analysis-set measurments 
4. 设计单位：点击analysis-set scale ，选择pixel单位
5. 分析条带：选择矩形选框工具，框住条带，点击Analysis-Gels-Selecit First Lane（或快捷键control +1）
6. 再次点击Analysis-Gels-Plot Lanes（或快捷键control +3）
7. 封闭开口：选择直线工具，画下直线，将开口封住
10. 得出数据：选择魔棒工具，依次点击各个框，即可得到相对应的灰度值数据
11. 复制数值至excel 表格。 三、 数据分析 1. 对于我们得到的数据，可以将目的蛋白的条带数值/内参条带的数值，再将得出的数值以对照组数据为参考做均一化处理，即可得到表达趋势值。 2. 我们可以将得到的数值标注在wb条带的下方，如果进行了3次重复实验，也可以通过prism软件进行数据处理，做成柱状图并进行统计学分析。对于分析方法，可以参考纽万生物发表的《运用Graphpad prism软件绘制柱状图》文章，即可做出对应的柱状图和进行统计学分析。 |
|
|
