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新员工培训--微生物知识及环境控制要求详解

 食品微生物检测 2023-06-09 发布于山东


食品微生物检测


第一部分、微生物知识

什么是微生物?

  • 定义:一大类个体微小、结构简单、形态多样,需借助显微镜才能看见的微小生物类群的总称。

  • 微生物通常包括病毒、细菌、真菌、原生动物和某些藻类。

微生物种类:

★细菌:肺炎球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌;

★真菌:霉菌、酵母菌、念珠菌(湿疹);

★放线菌:从放线菌中发现链霉素、土霉素;

★支原体:肺炎支原体;

★衣原体:沙眼;

★立克次体:斑疹伤寒;

★螺旋体:梅毒;

★病毒:甲、乙肝病毒,麻疹病毒,流感病毒。

细菌:是一类细胞细而短、直径一般为0.5~5.0um,结构简单、细胞壁坚韧,以二分裂方式无性繁殖的原核微生物,分布广泛。生长最适温度为30~35℃,主要去除方法有紫外杀菌法、滤膜过滤法及高温杀灭法等。

个别细菌如:嗜热脂肪芽孢杆菌,能在121℃条件,可耐受4~5min。

真菌:包括单细胞与多细胞两类,单细胞真菌呈圆形或卵圆形称为酵母菌;多细胞真菌由菌丝和孢子组成,称为丝状菌或霉菌。

真菌生长的最适的温度为23~28℃,一般加热60~70℃1小时即被杀死,用一定浓度的酒精及甲醛也可杀死。

病毒:属非细胞型微生物,在自然界分布非常广泛,可在人、动物、植物、真菌和细菌中寄居并引起感染。病毒是体积最小、结构最简单的微生物,它仅有一种核酸(DNA或RNA)作其遗传物质。

微生物五大共性

体积小、面积大:个体极其微小,必须借助显微镜放大几倍、几百倍、上千倍,乃至数万倍才能看清。

吸收多、转化快食谱广泛,凡是动植物能利用的营养,微生物都能利用,大量的动植物不能利用的物质,甚至剧毒的物质,微生物照样可以视为美味佳肴。

生长旺、繁殖快:二分裂是细菌最普遍、最主要的繁殖方式。

适应强、变异频:能耐0~-196℃的低温,可在250~300℃的高温条件下正常生长。

分布广、种类多:微生物几乎无处不有,无孔不入,地球上有200万生物,其中微生物有20万种之多。

微生物在自然界的分布:

土壤:是微生物生活的最适环境,土壤中的微生物又可分为如下几类: 

细菌:占土壤微生物总数的70%~90%。

放线菌:占土壤中微生物含量的5%~30%。

霉菌:主要生活在靠近地面的土壤中,在通气良好的土壤中,霉菌数量很多。

酵母菌:普通土壤中酵母菌含量很少。

➢水:仅次于土壤的微生物分布、定居的第二场所,90%为革兰氏阴性菌,主要有假单胞菌、黄杆菌等。

➢空气:空气中的微生物主要来源于带有微生物菌体及孢子的灰尘(这类微生物大多数是腐生性的,)还来源于人和动物,它们大多数是通过呼吸道排出的,其中也包含有病原微生物,悬浮在大气中。

微生物在人体中的分布:

在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种腔道(如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道)等部位,存在着对人体无害的微生物群。

部位

常见菌种

皮肤

表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、耻垢杆菌等

口腔

链球菌(甲型或乙型>、乳酸杆菌、螺旋体、梭形杆菌、白色念球菌、(真菌)表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、类白喉杆菌

正常一般无菌

肠道

类杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、厌氧性链球菌、粪链球菌、葡萄球菌、白色念球菌、乳酸杆菌、变形杆菌、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌等

鼻腔

甲型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、乙型链球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等

眼结膜

皮表葡萄球菌、结膜干燥杆菌、类白喉杆菌等

实验室中微生物的生长基质

★培养基:人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合体。

培养基中主要包含了微生物生长所需要的碳源、氮源、无机盐及微量元素

影响微生物生长繁殖的因素:营养、温度、渗透压、pH、水份、氧气、光照等。

消毒、灭菌概念

(1)灭菌  灭菌是采用强烈的理化因素杀死物体表面及内部的所有微生物(包括病原微生物和非病原微生物)繁殖体及芽孢的过程。灭菌后的物体不再有任何可存活的微生物营养体及其芽孢、孢子,即处于无菌状态,否则就是灭菌不彻底。

(2)消毒  消毒是用较为温和的理化因素仅杀死物体表面或内部一部分对人或动、植物有害的病原微生物,而对被消毒的对象基本无害的措施。一般消毒剂在常用浓度下只对细菌的营养体有效,对细菌的芽孢则无杀灭作用。

(3)防腐  食品防腐剂是能防止由微生物引起的腐败变质、延长食品保质期的添加剂。因兼有防止微生物繁殖引起食物中毒的作用,又称抗微生物剂(antimicrobial)。它的主要作用是抑制食品中微生物的繁殖。

消毒和灭菌前提条件:清洗干净!

热力灭菌:


灭菌(消毒)类型

温度与时间

杀菌范围

灭菌物品

干热灭菌

火焰灭菌

火焰灼烧

全部微生物

耐热物品、接种环、试管口等

热空气灭菌

160℃ 2h

玻璃器皿、金属用具、等耐热物品

湿热灭菌

高压蒸汽灭菌法

121℃ 15-30min

培养基、生理盐水、玻璃器皿等

115℃ 15-20min

湿热灭菌比干热效果好:

1.水蒸汽穿透力强;

2.菌体蛋白质吸收水分易凝固;

3.蒸汽凝结成水,放出潜热,提高物体温度;

化学消毒:

类别

名称

常用浓度

应用范围

作用机理

醇类

乙醇

70~75%

皮肤、体温计、器械消毒

脱水、蛋白质变性

表面活性剂

新洁尔灭

0.05~1%

皮肤、器械消毒

破坏细胞质、改变通透性

酸类

乳酸

0.33~1mol/L

空气消毒


氧化剂

过氧乙酸

0.2~0.5%(须严格控制浓度)

塑料、玻璃、纺织原料及人造纤维制品:也适用于食品表面消毒(水果、蔬菜、虽类)和环境地面消毒

与蛋白质活性基团反应,酶失活

氯制剂

漂白粉(次氨酸钙)

0.5~1.2%

饮用水、厂房和用具,
澄清溶液可用水果和蔬菜消毒

杀死细菌芽孢

卤素

氯气

0.2~1ppm

饮用水消毒

杀死细菌芽孢

酚类

来苏尔

1~2%

手、皮肤消毒

杀死细菌芽孢

3-5%

器械、地面消毒

第二部分环境控制要求

为什么要对食品生产进行微生物控制?

 微生物是食品加工中最主要的危害之一,其中尤以致病菌为甚。致病菌污染食物或食品微生物超标会造成食品的腐败、变质。而人们食用被污染、腐败、变质的食物后,会出现发烧、腹泻、中毒等症状,更有甚者会危及生命。

主要的微生物污染源

人员、设备、原辅料、法、环

人员与微生物

人员是洁净室中的最大污染源。

人在代谢过程中会释放和分泌污染物,人体表面、衣服能沾染、携带污染物,在洁净室内的各种动作也会产生微粒和微生物。GMP对人员有着严格的要求。

人体不同部位所带细菌数量

部位

细菌数(CFU)

手部

100~-1000/cm2

前额

1000~-100000/cm2

头皮

约100万/cm2

鼻腔分泌物

约1000万/g

唾液

约10亿/g


防范措施:

1.建立个人健康档案

新员工入厂全面体检,直接接触食品的生产人员每年至少体检一次,如发现有传染疾病应立即隔离。

2.清洁的个人卫生

①勤洗澡、理发、剪指甲;

②正确的洗手、更衣流程及防护方式;

3.洁净区内的自我约束

①不佩带首饰,不化妆;

②进出次数应可能地少,在操作过程中应减小动作幅度;

③规范各类操作及避免违规行为;

人员进入洁净区的程序

一次更鞋:阻断外界粘在鞋底的垃圾、颗粒及微生物。相对而言,脚底是最脏的部分。

脱去外套:阻断外界沉降在外套上的颗粒和微生物。

一更洗手:规范的洗手能消除手部皮肤的污垢和大部分的微生物。洗手一定要用洗手液和充足的流水。

二更

带口罩:阻断鼻腔、呼吸道的微生物发散,洁净区内不能脱下口罩。

带发套:阻断头发、头皮表面的微生物发散。保证发套完整的包裹头发。穿连体服:阻断体表皮肤的微生物发散。洁净区内不能解开连体服。

手消毒:再次消除手部的细菌和微生物。75%的酒精能杀灭手部95%以上的微生物。

定时或在任何关键操作前,应消毒手套

填写批记录后,手套应消毒

手的卫生

每只手可携带40万个细菌;

刚洗过的手,每平方厘米也可检验出3200个细菌。

洗手的重要性:

用流水(如自来水)洗手,能使手上的致病微生物减少80%;

用皂液充分洗手,再用自来水冲洗能使致病微生物减少95%。

洗手后正确使用消毒剂能使致病微生物减少到99%。

设备与微生物

设备的卫生应从设备的设计开始,要求产尘少、脱落粒子少、易清洗、消毒和灭菌。设备与物料的接触面不得与物料反应,不得吸附物料,设备的内表面材质要平整、光滑,凹凸不平的区域不仅不易清洗,而且易存留残液等,它将成为微生物繁殖滋生的场所。管道的安装要避免批与批之间的交叉污染,管道要能定期清洗消毒。

★防范措施:

①.建立相应的设备清洁保养制度及规程

②.保持一贯的清洁状态,发现污渍、污水、残余物等应立即清除

③.机修人员在线维修设备时,应注意操作尽量减少对食品、药品产生污染

④.对直接接触食品、药品的设备进行清洁验证

环境与微生物

环境中的微生物种类繁多,主要有附着于尘埃上的从地面飞起的球菌属(包括八叠球菌属在内的好氧菌)﹔形成孢子的好氧性杆菌(如枯草芽孢杆菌)﹔青霉等霉菌的孢子等。微生物的存在严重影响着食品、药品生产的安全,依次必须加以严格控制。

★防范措施:

.合理的厂房布局及高效的空气过滤系统

②.完善的洁净区日常卫生管理

③.每周进行空气消毒(臭氧熏蒸)

④.定期对洁净环境进行监测

洁净度测定包括:

微生物(悬浮粒子)

-浮游菌

-沉降菌

无菌药品的生产所需的洁净区可以分为四个级别

A 级:高风险操作区,如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域,应当用单向流操作台(罩)维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域必须均匀送风,风速为0.36-0.54m/s(指导值)。应当有数据证明单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内,可使用较低的风速。

B 级:指无菌配制和灌装等高风险操作A 级洁净区所处的背景区域。 

C 级和D 级:指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。

以上各级别空气悬浮粒子的标准与ISO14644-1中洁净度等级(以≥0.5μm和≥5μm的悬浮粒子为限度标准)的关系.

制药GMP车间洁净度等级要求

洁净区空气悬浮粒子的标准(用尘埃粒子计数器检测)

洁净度等级

空气中悬浮粒子最大允许浓度(个/m3)

静态

动态

≥0.5 µm

≥5.0 µm

≥0.5 µm

≥5.0 µm

A级

3520

20

3520

20

B级

3520

29

352000

2900

C级

352000

2900

3520000

29000

D级

3520000

29000

不作规定

不作规定

洁净区微生物监测的动态等级标准(可用浮游菌采样器检测)

洁净度等级

浮游菌

cfu/m3

沉降菌(φ90 mm)

cfu/4h

表面微生物

接触(φ55 mm)

cfu/碟

5指手套

cfu/手套

A级

<1

<1

<1

<1

B级

10

5

5

5

C级

100

50

25

/

D级

200

100

50

/

 注:此表摘自《药品生产质量管理规范2010版》

控制微生物污染途径环境控制

悬浮粒子的要求:附录1<无菌药品>第九、十条

1、A级区确认时的采样量不少于1m3

2、洁净区的动态监测

  • 悬浮粒子的动态监测

  • 关键操作的全过程,对A级区进行粒子监测

  • A级区的监测频率、取样量,及时发现人为干预、偶发事件及任何系统的破坏

  • B级区:类似于A级区,采样频率、采样量可以调整

  • C级区:质量风险管理原则确定

  • D级区:一般不作要求,(法规:必要时)

  • 对于C/D级区的自净时间应达到规定要求

微生物的要求:附录1<无菌药品>第十一条

监测方法有:

  • 空气浮游菌监测沉降菌法--被动法

定量空气浮游菌采样法--主动法

  • 环境表面监测

表面取样法(如棉签擦拭法和接触碟法)

  • 人员监测

表面取样法(接触碟法)

1.空气浮游菌监测

沉降菌法--被动法

  • 沉降碟在空气中的暴露时间4小时监控

  • 整个灌装过程

  • 只能给出定性和半定量的数据

  • 应结合空气浮游菌的数据,对沉降碟的结果进行评价

定量空气浮游菌采样法--主动法

  • 搤击式,离心式和膜过滤(明胶)取样仪

  • 应取一定体积的空气(取样体积应有代表性)

  • 仪器应经过校验

2.环境表面监测:表面取样法

应对接触产品表面、设备、地面、墙面等定期监测接触蝶法:适用于平整表面

  • 取样面积25cm2

  • 培养基略有凸起,高于碟子边缘,便于取样

  • 培养基中应含有中和剂/保护剂

棉签擦拭法:适用于不规则表面

  • 取样面积~25cm2

  • 定性或定量

表面样应在无菌操作结束时取

  • 以最大限度地降低无菌制造过程中关键表面污染的风险

3.人员监测

表面取样法(接触碟法),取样时间一般为:

  • 工作结束,离开洁净区前取样

  • 处理异常情况后(取样后重新更衣或更换手套)。

  • 生产过程中随时监测

特别注意:

  • 不得在刚消毒过后取样

日常环境监测频次:

测试项目

环境级别

测试频率


A级

两周1次

沉降菌/浮游菌

C级

一个月1次


D级

两个月1次


A级/B级

两周1次

悬浮粒子

C级

一个月1次


D级

两个月1次


A级/C级

每班生产结束

手和操作服

C级

一个月1次


D级

三个月1次

洁净区监测的位置取样位置选择时考虑因素:

  • 哪些部位的微生物污染最可能对产品质量造成不良影响?

  • 在生产过程中,什么地点最容易长菌?

  • 哪些地方是清洁、消毒或灭菌时最难覆盖/接触或最难奏效的部位?

  • 什么活动会导致污染的扩散?

  • 在某一部位的取样操作,足以导致测试数据的差错或污染产品﹖取样只应在生产结尾换班时进行吗?

洁净区监测的位置

  • 应符合“GB16292-2010”、“GB16294-2010”的要求

  • 基于风险的设计

监测点设置在潜在风险最大的位置

a)食品、药品

b)容器

c)连接处

d)人流和物流经过的地方

e)监测点靠近“工作高度”

示例:无菌灌装线

  • 取样点应在产品或组件暴露的区域周围取样,如:

    在灌装针头处

    将产品装载入冻干腔室处

    胶塞供料桶

    无菌部件进行连接操作的部位

    操作人员频繁活动处(不影响生产过程)

  • 注意:靠近产品,但不接触产品的位置

浮游菌、沉降菌取样点

  • 沉降菌、浮游菌:监控点位置,高度一般为离地80cm左右或操作台面

  • 浮游菌、沉降菌监控点的设置根据生产工艺及污染风险综合考虑

洁净区表面微生物取样点

  • C级区取样点:一般为地面、墙面及操作人员十指手套。对C级下的局部A级区取样宜在生产结束后进行,避免造成污染。

环境监测常用仪器/设备/培养基

    悬浮粒子          浮游菌          表面微生物检测      沉降菌

预制培养平板包装

  • 无菌区使用预制平板:一般采用三层包装形式:

预制平板进入洁净区

  • 预制平板进入无菌区,须避免对监控区域的污染。

预制平板脱包装

  • 经传递窗进入洁净区的预制培养平板继续脱去外面两层包装就可以使用。

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