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▼ ▼ 陈晓俊 王凤琛 袁 颖 张 磊 李欣丹 金素安 何世民 王健英 上海中医药大学中药学院,上海 201203 上海中医药大学上海中医健康服务协同创新中心,上海 201203 上海中医药大学教学实验中心,上海 201203 摘要:目的比较杜仲皮、杜仲叶、杜仲雄花在抗炎、镇痛、抑菌、免疫调节等药效学方面的作用。方法 分别设杜仲皮、杜仲叶、杜仲雄花水提取物高、低剂量组,采用免疫器官称重法、二甲苯致小鼠耳肿胀试验、醋酸致小鼠扭体试验、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌体外抑菌试验,分别评价杜仲不同部位水提取物的免疫调节、抗炎、镇痛、抑菌作用。结果 杜仲不同部位水提取物均可提高脾脏及胸腺指数,且杜仲雄花高剂量组的提高作用更明显,差异均有统计意义(P<0.05 或P<0.01);杜仲不同部位水提取物可不同程度抑制小鼠耳肿胀,其中杜仲雄花高剂量组抑制作用最强,差异有高度统计意义(P<0.01);杜仲皮、杜仲叶、杜仲雄花的高剂量组均能减少小鼠的扭体次数,且杜仲雄花高剂量组小鼠扭体次数减少更明显,差异有高度统计意义(P<0. 01);杜仲雄花水提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌浓度最低,有较好的抑菌作用。结论 杜仲皮、杜仲叶、杜仲雄花在各药效上的作用功效各不相同,合理使用其用药部位是今后研究的方向。 关键词:杜仲皮;杜仲叶;杜仲雄花;药效学 杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)属杜仲科植物,是我国特有的单科、单属、单种的植物,其主要成分有环烯醚萜类、杜仲胶、木脂素类及苯丙素类等40 多种化合物,其中木脂素类及环烯醚萜类所占的比例较大,其次是黄酮类及其他类化合物。2015 版《中华人民共和国药典》中收载杜仲、杜仲叶2 个品种,其中杜仲药用杜仲的树皮。功效均为补肝肾、强筋骨,用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力。而杜仲雄花目前多作为花茶应用,研究认为其具有良好的镇静催眠作用[1] 。杜仲皮、杜仲叶、杜仲雄花均来源于杜仲,在药理作用方面的差异尚不明确。本研究拟从抗炎、镇痛、抑菌、免疫调节等方面比较三者的作用,初步探讨其作用差异,为杜仲的药用研究拓宽思路。 1 实验材料 1. 1 实验动物 幼年ICR 小鼠,雄性,体质量(20±2) g,由上海中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号:SCXK(沪)2012-0002。适应性喂养3d。 1. 2 仪器、试剂与药材 1. 2. 1 实验仪器及试剂 BSA124S 电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司),XS105 电子天平(METTLER TOLEDO),RB-200 智能热板仪(成都泰盟科技有限公司),RE-52AA 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),Bact-IST 0.5 麦氏比浊管(上海青阳科技生物有限公司);营养肉汤(上海华康科技开发公司,中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心,批号20140901),营养琼脂(上海中科昆虫生物技术开发有限公司,批号20131002)。 1. 2. 2 药材及药液的制备 杜仲皮、杜仲叶、杜仲花均采自湖南省张家界,经上海中医药大学生药教研室吴靳荣副教授鉴定,实验用样品分别为杜仲科植物杜仲的干燥皮、叶及雄花的炮制品杜仲雄花茶。分别取杜仲皮、杜仲叶、杜仲雄花各100 g,加入一定量的清水浸泡30 min,加水没过药面l cm,煎煮3次,时间分别为60,40,20min,合并3次滤液,浓缩至100mL(含生药1 g/ mL),装瓶备用。 1. 3 实验菌株 金黄色葡萄球菌,CMCC(B)26003,大肠杆菌,CMCC(B)44102,白色念珠菌,CMCC(F)98001,上海东标药检器材有限公司。 2 方法 2. 1 杜仲不同部位水提取物对小鼠免疫器官的影响 将70只雄性ICR小鼠随机分为7组,分别为空白组,杜仲皮高、低剂量组,杜仲叶高、低剂量组,杜仲雄花高、低剂量组,每组10只。杜仲皮、叶、雄花高剂量组均按5 g/ kg 剂量灌胃,杜仲皮、叶、雄花低剂量组均按0.8 g/ kg 剂量灌胃。空白组灌胃等量生理盐水。每日1次,连续给药14 d。于末次灌胃30min后处死。取出胸腺、脾脏,称定质量,根据以下公式计算胸腺指数、脾脏指数。胸腺指数=(胸腺质量/ 小鼠体质量)×100%脾脏指数=(脾脏质量/ 小鼠体质量)×100% [2] 2. 2 杜仲不同部位水提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 将80 只雄性ICR 小鼠随机分为8组,分别为空白组,杜仲皮高、低剂量组,杜仲叶高、低剂量组,杜仲雄花高、低剂量组,阳性对照组,每组10只。阳性对照组灌胃阿司匹林0.25 g/ kg,余给药方法同“2. 1”。于末次灌胃30min 后,取0.02mL 二甲苯均匀涂在每只小鼠的右耳内外两面致炎,左耳不致炎作为对照。致炎30min 后迅速脱颈椎处死小鼠,沿耳郭剪下左右两耳,用直径9mm 的不锈钢圆冲沿耳缘相同部位冲下并重复1次,每耳得到相同直径的2片耳片,并用分析天平称取耳片的质量。以左右耳片质量差作为肿胀度,计算肿胀抑制率。肿胀抑制率= (空白组肿胀度-给药组肿胀度) / 空白组肿胀度×100%。 2. 3 杜仲不同部位水提取物的镇痛作用 将80只雄性ICR小鼠随机分为8组,分别为空白组,杜仲皮高、低剂量组,杜仲叶高、低剂量组,杜仲雄花高、低剂量组,阳性对照组,每组10只。给药方法同“2. 2”,每日给药1次,共7d。于末次给药后1h,各组小鼠均腹腔注射0.6% 醋酸0.2 mL,记录注射醋酸后20min 内小鼠的扭体次数。扭体抑制率(%)= (对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数) / 对照组平均扭体次数×100% [3] 。 2. 4 杜仲不同部位水提取物的抑菌作用 2.4. 1 葡萄糖酚红肉汤的配制 称取营养肉汤粉18 g,葡萄糖10 g,1% 的酚红1 ~2 mL,加热溶解于1000 mL 蒸馏水中,再分别加入2mL于试管中备用;上述3种菌株均能分解葡萄糖,使酚红由红色变成黄色。从而使结果易于判断。 2. 4. 2 含药液体培养基的配制 1)取44孔(每排11孔)试管架,每种药物、每种菌株做2个平行对照。2)先在每排试管中加入2mL 葡萄糖酚红肉汤,再于每架试管的第1 支试管分别加入药液2 mL。并进行1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64,1/128,1/256,1/512,1/1 024,1/2 048 稀释,第11支试管混匀后取出2mL 弃掉。取2支试管为对照管,不加药物,加菌株,观察细菌在培养基上能否正常生长。取2支试管为对照管,不加药物,不加菌株,观察培养基是否正常。药物对照组药物同上对倍稀释,不加菌株,液体培养基保持红色,说明该管培养基无细菌污染和生长[4-5] 。 2. 4. 3 菌株的接种与培养 将上述3 种实验用细菌接种于营养肉汤液体培养基,37 ℃ 培养16 ~18 h,视细菌生长的情况再用营养肉汤作1/10 ~1/1 000 稀释。将稀释后的细菌分别取0.1 mL 加入上述含药液体培养基中,37 ℃ 培养18 ~ 24 h,观察细菌生长情况。 2.4. 4 抑菌实验结果判断 液体培养基由红色变成黄色,说明该管培养基有细菌生长,如果液体培养基保持红色,说明该管培养基无细菌生长,以仍然保持红色的试管的药物最高稀释浓度判定为最低抑菌浓度(MIC)的终点[6] 。 3 统计方法 采用SPSS18.0统计软件进行数据处理,计量资料以x±s 表示,采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法(若方差不齐采用Games-Howell 法)。P<0.05表示差异有统计意义。 4 结果 4. 1 杜仲不同部位水提物对小鼠胸腺及脾脏指数的影响 杜仲不同部位水提取物均可提高脾脏及胸腺指数,且杜仲雄花高剂量组的提高作用更明显,差异均有统计意义(P<0.05 或P<0.01)。详见表1。 4. 2 杜仲不同部位水提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 与空白组比较,杜仲皮高剂量组,杜仲叶高、低剂量组,杜仲雄花高、低剂量组耳郭肿胀度显著降低,差异均有高度统计意义(P<0. 01)。与其他组比较,杜仲雄花高剂量组抑制作用更明显,差异均有高度统计意义(P<0. 01)。详见表2。 4. 3 杜仲不同部位水提取物对小鼠镇痛作用的影响 与空白组比较,杜仲皮、叶、雄花高剂量组的小鼠扭体次数显著减少,差异均有高度统计意义(P<0. 01);且杜仲雄花高剂量组对小鼠扭体的抑制作用更为显著,与杜仲皮、叶高剂量组比较差异均有高度统计意义(P<0. 01)。详见表3。 4. 4 杜仲不同部位水提物的抑菌作用比较 杜仲雄花、杜仲皮及杜仲叶水提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌作用比较,杜仲雄花的最低抑菌浓度最小,说明其抑菌作用最强。详见表4。 5 讨论 杜仲的主要有效成分为黄酮类和多糖类化合物,这2 类化合物多具有抑菌、消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌、防癌等诸多生理活性[7] 。本研究中,二甲苯致小鼠耳肿胀度结果表明杜仲不同部位水提物有不同程度的抗炎作用(P<0. 01),其中杜仲雄花组高剂量对耳肿胀的抑制作用明显(P<0. 01)。因此在抗炎的有效成分上,杜仲雄花是否具有更多的黄酮类和多糖类成分可以做进一步的研究。 在镇痛实验中,扭体法是通过化学刺激致痛,类似于炎性疼痛。实验结果表明杜仲雄花高剂量水提物能明显减少小鼠的扭体次数,提高扭体抑制率(P<0. 01)。分析其镇痛作用可能与其抑制末梢神经对疼痛刺激的敏感性及抗炎作用有关,今后对于杜仲雄花的研究可以进一步通过检测炎症局部的花生四烯酸、前列腺素、缓激肽等的含量,对其抗炎作用是否与抑制环加氧酶有关进行研究[8] 。 抑菌实验采用经典的肉汤稀释法来比较各水提取物对不同细菌的最低抑菌浓度。因肉汤稀释法避免了药物于琼脂平板中扩散动力学的多种影响因素,药物分子可直接与细菌菌体接触而与体内情况接近,其结果较接近临床情况,但中药制剂所含成分复杂,离子强度、pH、鞣质、溶解情况等都对结果有影响,故对结果的解释要慎重。本实验的药物提取水溶液的色泽较浓,考虑会影响结果的判定,故用葡萄糖酚红肉汤代替普通肉汤。在此培养基中,细菌生长使葡萄糖发酵产酸,从而使酚红变为黄色,以仍保持红色的试管的药物最高稀释浓度判定MIC 终点。结果显示杜仲雄花的抑菌作用最佳,其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的最低抑菌浓度均比杜仲皮、杜仲叶水提取物低,显示杜仲雄花有较好的抑菌作用。 综上所述,杜仲皮、叶、雄花在各药效上的作用效果各不相同,如何有效使用杜仲的药用部位,合理开发杜仲雄花在抗炎等领域的作用,是今后我们研究的方向。 参考文献略 |
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