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题目：A multifunctional true caffeoyl coenzyme A O-methyltransferase enzyme participates in the biosynthesis of polymethoxylated flavones in citrus 刊名：Plant Physiology 作者：Zhenkun Liao, Chongde Sun et al. 单位：Zhejiang University, Hangzhou 日期：22 April 2023    01 摘要  多甲氧基黄酮(PMFs)因其丰富的生物活性而受到广泛关注。柑橘皮积累了丰富的PMF，而甲基化修饰是PMF生物合成的关键步骤;已报道的柑橘o -甲基转移酶(OMT)的功能不足以阐明PMFs的完全甲基化过程。 本研究以甜橙品种“冰糖城”为材料，分析了不同发育阶段黄系中PMFs的积累规律。结果表明，PMFs的积累在果实发育早期(开花后60 d)完成。 此外，我们还鉴定了一个真正的咖啡酰基coao -甲基转移酶(命名为CsCCoAOMT1)。体外功能分析表明，CsCCoAOMT1优先选择类黄酮，而不是咖啡酰辅酶a和秦皮甲素。这种酶有效地甲基化了多种类黄酮的6-、7- 8-和3 ' -羟基，并具有邻羟基，对槲皮素(黄酮醇)和黄酮有强烈的偏好。 瞬时过表达和病毒诱导基因沉默实验验证了CsCCoAOMT1可以促进柑橘中PMFs的积累。这些结果揭示了真正的CCoAOMTs的功能，表明CsCCoAOMT1是一个高效的多功能o -甲基转移酶，参与柑橘PMFs的生物合成。 02 技术路线  RNA isolation, RNA sequencing, RT-qPCR and protein quantifying Phylogenetic analyses and sequence alignment Isolation, cloning, and heterologous expression of CsCCoAOMT1 Enzyme assays and kinetic Transient overexpression of CsCCoAOMT1 in citrus fruit peel TRV-mediated virus-induced gene silencing in citrus seedlings Metabolite analysis Flavonoids analyses by HPLC 03 主要结果 3.1 OMTs的系统进化分析 为了研究参与PMFs生物合成的OMT基因，我们从RNA-seq数据库中筛选出70个在不同发育阶段表达的OMT基因(FPKM值≥0)，并结合基因组版本1.0和结构域完整性。系统进化分析将这些OMTs分为两个亚家族:COMTs(绿色底部)和CCoAOMTs(橙色底部)。COMT亚家族包含63个成员，CCoAOMT亚家族包含7个成员(图1;补充表S1)。在系统发育树中显示了具有功能特征的柑橘OMTs的推测同源基因，包括三个与类黄酮甲基化相关的COMTs (CdFOMT5, CrOMT2/CitOMT, CitOMT2)和一个CCoAOMT (CrOMT1)。 我们还对这些OMTs的系统发生树、基因结构和蛋白结构进行了交互分析，以探索不同亚家族成员之间的差异(补充图S1)。COMT亚家族成员在基因结构上表现出更多的多样性，其大部分蛋白含有二聚化结构域(pfam: pfam08100)的n端结构域和AdoMet_Mtases超家族结构域，而CCoAOMT亚家族成员的基因结构分布更为保守，仅含有一个AdoMet_Mtases超家族蛋白结构域。此外，COMTs包含大量的保守基序(2 ~ 12)，并且在不同的COMTs成员之间存在差异。相反，ccoaomt在不同成员之间共享较少(2)和相似的基序。
图1'冰糖橙’中OMTs的系统进化分析 3.2 '冰糖橙’果皮成熟过程中PMF的积累 我们在'冰糖城’果实的不同发育阶段测定了PMF含量(图2A)。在所有发育阶段共检测到6种PMFs，包括异七叶皂苷、青七叶皂苷、川陈皮素、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮、七甲氧基黄酮和橘皮素，其中青七叶皂苷含量最高，平均含量为2.78 mg·g-1 FW(图2B和图2C)。PMFs除七甲基乙氧基黄酮(heptamethoxyflavone)外，在果实发育早期都有较高的水平，在S2(开花后60 d)达到峰值，在果实发育后期逐渐下降(图2B)。黄烷酮橙皮苷与PMFs共同构成'冰糖城’的总黄酮;在发育阶段，总黄酮表现出与PMFs相似的趋势。
3.3 从'冰糖橙’黄系中分离出一个候选CCoAOMT基因(CsCCoAOMT1) 在鉴定柑橘类黄酮OMTs时，许多研究都集中在COMT亚家族，包括其功能预测、基因克隆和功能表征，最终在体外鉴定出3个参与类黄酮甲基化的COMT(对应于Cs2g05400;Cs5g16290;然而，这些已报道的COMT基因仍然不足以阐明柑橘中PMFs的所有甲基化位点。 最近，我们报道了一个CCoAOMT (CrOMT1)参与柑橘类黄酮的甲基化，这促使我们在后续研究中筛选参与PMF生物合成的omt时，将重点关注CCoAOMT亚家族。我们分析了'冰糖橙’果实不同发育阶段黄系中CCoAOMT亚家族7个成员的转录水平(图3A)。两个CCoAOMT基因(Cs1g22450和Cs8g05410)在发育早期表现出明显的高表达，这与此时PMFs的快速积累相吻合(图2);因此，这两个基因被认为是参与PMF生物合成的候选基因。 其中一个候选基因(Cs1g22450)被认为与其假定的同源基因(CrOMT1来自C. reticulata)具有相同的催化活性，而CrOMT1已被证明参与柑橘中PMF的生物合成。因此，另一个候选基因(Cs8g05410，命名为CsCCoAOMT1)成为本研究的兴趣。 为了进一步阐明CsCCoAOMT1的系统发生关系，我们选取了已鉴定的华支睾吸虫CCoAOMTs和34个不同植物的CCoAOMTs构建系统发生树(图3B)。这些ccoaomt可分为两个主要分支:CCoAOMT-like和ccoaomt。CsCCoAOMT1位于真正的CCoAOMTs分支，并与其他植物(如V. vinifera、苜蓿(Medicago sativa)、subabul (Leucaena leucocephala)和poplar (Populus trichocarpa)的真正CCoAOMT基因聚类。在蛋白质水平对植物CCoAOMT进行的多重序列比对表明了两个CCoAOMT亚组之间的分歧(补充图S3)。在真正的CCoAOMTs亚组中，与底物识别相关的三个氨基酸残基(206R, 208Y和212Y，用红色星号标记)是保守的;然而，在CCoAOMT-like亚组成员中，这些位置被其他不同的氨基酸残基取代。综上所述，CsCCoAOMT1是一个真正的可能参与PMF生物合成的CCoAOMT，并且由于底物识别位点的差异，可能表现出与CCoAOMT样亚家族成员不同的底物选择性。
3.4 CsCCoAOMT1在'冰糖城’果皮中的瞬时过表达 '冰糖橙’果实的果皮是PMFs的丰富来源，我们利用S5期的'冰糖橙’果实，通过瞬时过表达CsCCoAOMT1来探索CsCCoAOMT1在体内对类黄酮甲基化的潜在作用。 将含有CsCCoAOMT1-pBI121和对照(pBI121)的悬液注射在同一'冰糖橙’果实的相对两侧。结果显示，与注射空载体的对照组相比，CsCCoAOMT1的转录水平显著上调(2.2倍)，CsCCoAOMT1蛋白的丰度也上调(1.1倍)(图6A和补充图S6A)。在注射了CsCCoAOMT1-pBI菌悬液的'冰糖果’果皮中，六种主要PMFs(异皂苷、青皂苷、川陈皮素、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮、七甲氧基黄酮和橘皮素)的含量也显著增加，分别增加了2倍、1.4倍、1.9倍、1.1倍、1.1倍和1.8倍(图6B)，其中七甲氧基黄酮和川陈皮素的差异达到了极显著水平(P<0.01)。
3.5 病毒诱导的'jincheng’幼苗CsCCoAOMT1基因沉默 以'jincheng’种子为材料，对CsCCoAOMT1进行病毒诱导基因沉默(VIGS)。与TRV2空载体转化的对照植物相比，CsCCoAOMT1在所有6个阳性细胞株中的表达水平均显著降低，其中在VIGS-3和VIGS-5细胞株中降低幅度最大(图7A)。 在VIGS样本中，CsCCoAOMT1蛋白的丰度下调(1.1倍)(补充图S6B)。CsCCoAOMT1表达水平的降低也导致阳性植株的总黄酮含量不同程度的降低，且CsCCoAOMT1表达水平与VIGS植株的总黄酮含量一致(图7A、7B)。与CK组的平均值(0.850 mg·g-1 FW)相比，VIGS-3 (0.427 mg·g-1 FW)和VIGS-5 (0.546 mg·g-1 FW)总黄酮含量分别下降了49.8%和35.8%(图7B)。 在csccoaomt1沉默的细胞系中，五种主要的pmf(青花素、川陈皮素、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮、橘皮素和5- hpmf)均有不同程度的显著下降。主要黄烷酮(橙皮苷)也略有下降，但不显著(图7C)。这些结果直接证明了CsCCoAOMT1参与柑橘类黄酮的生物合成，并有效促进PMFs的产生。
 04 结论 详细描述了柑橘果皮发育过程中PMF含量的动态变化，并捕获了PMF生物合成的关键时期。此外，我们在柑橘中鉴定了一个真正的CCoAOMT酶，CsCCoAOMT1，并发现它在体外表现出对槲皮素和黄酮底物的强烈偏好，在6,7,8和3'15位点的羟基与邻近的羟基环境进行甲基化，这些羟基是PMF生物合成的重要位点。 CsCCoAOMT1是一种多功能酶，对咖啡酰辅酶a和esculetin表现出较低的催化活性。体内瞬时过表达和VIGS实验验证了CsCCoAOMT1在促进柑橘中各种PMFs的生物合成方面具有重要作用(图8)。这些发现对于改善柑橘果实的营养品质以及酶工程合成天然生物活性物质具有重要意义. 05 原文获取 原文链接： https:///10.1093/plphys/kiad249 PDF获取： https://www./h-nd-216.html 文末附件 END 06 广告 |
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