Hplc色谱柱 阴离子交换柱使用

【2】Hplc色谱柱 阴离子交换柱使用手 

阴离子交换柱使用手册

Chrompack HPLC IonoSpher A Columns

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注意

Chrompack IonoSpher A 色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。

在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。

1． 简介

Chrompack IonoSpher A 柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。

2． 色谱柱老化

在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。

要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。

在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。

3． 洗脱液

推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者UV吸收的缓冲液，例如磷酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。

绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。另外，硝酸铵（1mM）可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。

洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。

一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。

4． 流量和压力

柱内径（毫米） 流速 （ml/min）

最佳 最高

2.0 0.2 1.0

3.0 0.4 2.0

4.6 1.0 4.0

10.0 4.7 18.0

注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi

增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。

如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。

拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。

高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。

使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。

5． 样品准备

保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱， 不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。

6． 保护柱

一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep 柱我们建议使用ChromSep Anion 交换保护柱。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用Chromguard Anion exchange High Efficiency（高效）柱(10X3.0mm) 或High Capacity（高容量）柱(50X3.0mm)。

7． 进样量和浓度

柱尺寸

长度*内径 最大样品体积

250×2.0mm ±10μl

200×3.0mm ±15μl

250×4.6mm ±50μl

250×10.0mm ±250μl

当样品的洗提强度比洗脱液低（在柱样品预浓缩）的时候，更高的样品量也可以注射。

8． 温度

Chrompack IonoSpher A 柱可以在室温环境使用。为了提高柱子的稳定性，建议不要在40°C以上使用。

9． 贮存

在贮存柱子以前，建议先用去离子水，然后用甲醇冲洗。一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。

10． 检测灵敏度

对于使用邻苯二甲酸缓冲液作为洗脱液的阴离子的检测，以下几种方法可用：

·折光检测

·电导检测

·紫外检测

邻苯二甲酸缓冲液对所有三种检测方法都是特别好的，因为邻苯二甲酸缓冲液具有高的折光性，相对低的电导率和紫外吸收性质。检测波长取决于要检测的离子。

11． 系统峰

当你使用Chrompack IonoSpher A 柱的时候，系统峰可能会出现。通常一个馏分既溶剂在前面，第二个馏分应当是硫酸盐。方向（正峰或负峰）取决于样品的pH。位置取决于流动相的Ph。较低pH会使系统峰向前移动。在我们的实验中pH值在3.8-4.3之间最佳。

12．柱效损失的可能原因

1． 额外的峰展宽。要保证管路的长度和内径都保持最小。

2． 洗脱的平衡时间不够。

3． 不正确的洗脱液pH或洗脱液的离子强度。

4． 洗脱液中存在不正确离子。

5． 固定相污染。

a. 高柱压伴随分辨率降低。

1． 颗粒物积聚在烧结物或者填充物床上。

（a） 样品来源---过滤或离心

（b） 洗脱液来源---过滤洗脱液，封闭洗脱液容器。

（c） 系统来源---冲洗整个系统管路和泵；安装在线系统过滤器。

2． 蛋白质类物质的积聚

（a） 微生物在样品中生长。

3． 微生物在洗脱液中生长。

b. 正常柱压伴随柱效降低

1． 有机污染

（a） 样品中有脂肪，油脂，脂质。固定相的表面被覆盖。

（b） 从样品中带来的不确切的有机物或未正确制备的洗脱液。

（c） 在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定有机物，例如在运输时从大气中带来。

13.对于纠正污染问题的可能有效的操作

1． 准备新鲜的洗脱液

在很多情况下，柱效的丧失可以归结为洗脱液的污染。所以，要在使用柱子以前准备新鲜的洗脱液，冲洗所有液体管路。洗脱液应当用0.2到0.4微米的滤膜过滤，在使用以前要脱气。

2． 色谱柱再生

要进行色谱柱的再生工作

a． 首先使色谱柱反向

b． 以0.4ml/min的流速用1M硝酸铵洗脱30ml。

c． 以0.4ml/min的流速用40：60 （v：v）的甲醇/水洗脱30ml。

d． 以0.4ml/min的流速用异丙醇洗脱30ml。

e． 以0.4ml/min的流速用水洗脱30ml。

f． 以0.4ml/min的流速用洗脱液洗脱30ml。

g． 将柱子转回正常方向。

用洗脱液平衡。。

以上内容由美国瓦里安技术中国有限公司北京办事处李华译自Chrompack IonoSpher A 柱随柱附带操作手册。 

2002年5月14日

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