实时动态光学成像以其独特的高灵敏度和时空分辨率，在生物医学工程的成像领域引起了广泛的关注。特别是，实时动态多重成像对于研究由复杂生物相互作用调节的病理生理过程至关重要，包括细胞介导的免疫反应、心血管疾病相关血流动力学和神经元回路的潜在活动。迄今为止，这些研究的实施主要依赖于带有可见荧光探针。然而与单光子激发相比，由于非线性光学过程多光子激发遭受剧烈的荧光衰减。因此，需要侵入性手术来暴露组织以防止光衰减。最近，第二近红外（NIR-II）窗口成像由于减少了组织中光子散射和自发荧光，促进了具有更深穿透深度的非侵入性生物成像。目前，NIR-II成像监测的动态过程主要依赖于通过切换滤光片对单个探测器顺序获得的快照进行积分。非侵入性实时动态的可视化血流动力学和多细胞动力学仍然是一个挑战。为了解决这个问题，在NIR-IIb区（1500-1700nm）发射的明亮荧光探针是必不可少的，因为该区域提供了光子散射和组织自发荧光的最佳平衡。镧系元素下转化纳米颗粒（DSNP）是实现此目的的理想候选探针，因为它们的NIR-II波长可调谐，发射带宽窄，吸收和发射之间的光谱分离大。近日，复旦大学聚合物分子工程国家重点实验室的张凡教授率领其团队报道了一项适用于深层组织的非侵入性体内实时动态多重成像平台。张凡团队专注于近红外光学探针设计与合成，生物医学成像和光学成像仪器设计的研究领域。他们开发了新的NIR成像探针库，并利用这些探针促进生物医学和临床应用的进步。此次,张凡团队开发了一种立方相铥基纳米颗粒（α-TmNPs），可以实现近红外Ⅱb区的荧光放大。同时，可以利用参杂其他稀土元素实现对发射光谱的调整。作者团队进一步开发了掺铒的α-ErNPs，与α-TmNPs构成了高同步性与准确性的双通道成像系统，实现了对于小鼠脑卒中模型中血管相关活动的无创实时动态成像。作者团队报道了一种在1632nm处发射荧光的铥基立方相纳米颗粒（DSNP），呈现Yb0.8/Tm0.08@NaYbF4@NaYF4（α-TmNPs）的多层核壳结构。透射电子显微镜（TEM）图像显示呈现均匀球形，粒径~16nm。在α-TmNPs中，Tm3+从Yb3+中提取激发能，在1632nm处产生增强的荧光纳米，比传统的六方相铥基纳米颗粒（β-TmNPs）在1475nm的荧光亮约50倍。但是α-TmNPs的上转换发光效率明显降低，只有约为14.0%。低温吸收光谱证实1632 nm荧光源自3F4晶体的斯塔克效应，这是能级分裂的结果。1632nm处的发射强度与激发功率呈非线性关系，这可能涉及了多光子跃迁过程，对应3F4 → 3H6。到目前为止，基于Er的DSNP在1530nm处发射荧光已经被报道用于深层组织生物成像，由于与吸水带的部分光谱重叠导致其易荧光猝灭。而1632nm发射峰与吸水曲线重合小。α-TmNPs、α-ErNPs与α-HoNPs比较在仿生体液中的性能，由于长波长下水吸收较小，散射效应最小，α-TmNPs显示出最好高的分辨率和信底比。此外，α-TmNPs和α-ErNPs在NIR-IIb区域的光学性能优于具有较短NIR-II发射的α-HoNPs，这表明它们在体内NIR-IIb多重成像的潜在应用前景。接下来探索1632 nm荧光放大机制。除了晶体场效应外，还观察到多声子辅助的非辐射弛豫（MPR）效应。α-TmNPs在80–290k范围内呈现的温度依赖性发光，说明从3H4和1G4能级跃迁强度降低而3F4能级增强。相反的趋势归因于随着温度的升高，非辐射的3H4 → 3F4转换加速。α-TmNPs在1475nm处的荧光衰减超过β-TmNPs说明更多的能量通过非辐射路径耗竭。考虑到发射极含量可能对发光跃迁产生重要影响，接下来关注Tm3+之间的交叉弛豫现象。1632nm发射光持续增强直到Tm3+含量达到~8mmol%，而475nm的发光转变随Tm3+含量增加而衰减，并且1475nm发射强度在Tm3+含量5 mmol%时最强，表明Tm3+–Tm3+交叉弛豫通过3H4 + 3H6 → 3F4 + 3F4显著促进3F4数目。根据能隙定律，这种交叉弛豫过程的能量失配可以被立方相中的高能声子效地桥接，这有助于1632nm的荧光放大。核心中Yb3+含量的升高通过Yb3+介导的向后-向前能量转移（BFET）进一步增强了1632nm发射荧光。除了作为敏化剂吸收980nm光子将激发能转移到Tm3+，Yb3+（80 mmol%）通过反向能量转移（BET）捕获来自Tm3+（3H4）的能量，然后通过正向能量转移（FET）激发Tm3+（3F4）。此外，MPR和BFET效应也被验证用于增强Ho3+和Er3+掺杂的纳米颗粒的降频荧光。这里观察到优化的α-HoNPs（NaYbF4:Ho0.2@NaYbF4@NaYF4）和α-ErNPs（NaYbF4:Er0.1@NaYbF4@NaYF4）与其β相对应物的比较显著增强了荧光强度，表明该策略的普适性。对于实时动态多重成像来说，多通道在时间和空间上同步的信号捕获是必不可少的。为此，构建了一个带有两个InGaAs相机的双通道NIR-IIb荧光成像系统，该系统允许以每秒110帧的最大速度进行动态成像。在存在高散射小鼠头骨或皮肤的情况下，两个NIR-IIb通道显示出相当的空间分辨率和单色性，Tm通道（表示为Tm-Ch）和Er通道（表示为Er-Ch）中的珠粒直径几乎不变，证明了具有高空间分辨率的深层组织多重成像的可行性。进一步采用微流控系统来验证成像系统的实时动态多路成像能力。将Tm/Er标记的聚苯乙烯（PS）珠粒分散在十六烷中，然后以25ml/h的流速泵入流动通道，在20秒内随机跟踪六颗珠子的运动。定量结果显示珠子的平均速度Er Ch中为66.0–1180.4 μm/min，而Tm Ch中为68.0–1172.3 μm/min，显示两个成像通道之间的微小标准偏差。使脑血流动力学的无创荧光成像无需创建颅骨窗口，对于脑血管疾病的准确检测意义极大。与NIR-IIa区相比，NIR-IIb区在血管成像中显示出显著优势，如Tm Ch（11.3–21.3）和Er Ch（7.7–15.3）的信噪比比Ho Ch（1.1–1.3）高约7–16倍。得益于NIR-IIb成像在深层组织中的优势，Alexa Fluor 633偶联的α-ErNPs（α-Er@Af633)和α-TmNPs可以分别选择性地突出脑动脉和脑血管上的弹性纤维。注射后4 h后，上矢状窦（SSS）附近的动脉壁清晰可见，其中信号在8 h内保持稳定，持续时间超过24 h。TEM图像显示α-Er@Af633（~13 nm），进一步表明纳米颗粒从血管腔渗出并标记动脉壁。多重成像显示了不同水平的脑血管，包括通过弹性纤维标记和血管直径识别。在约50s的时间过程中监测麻醉小鼠大脑血管的自发直径变化。进一步应用去甲肾上腺素刺激来模拟神经血管耦合效应。静脉注射去甲肾上腺素后，在Er-Ch和Tm-Ch中都观察到收缩幅度大于20%的动脉收缩，而在不使用药物时，它维持稳定。相关分析表明用于捕获自发血管收缩时表现出高时空同步。中性粒细胞被认为是急性炎症的第一反应者。评估中性粒细胞的体内实时动态成像，将Ly6G抗体标记的α-TmNPs（α-Tm-aLy6G）注射到患有皮下耳部炎症的小鼠中。10h的实时多重传输图像显示血管中中性粒细胞自由流动（~4410 μm/min），表明它们处于未刺激和静息状态。此外，定向迁移至单个粘附中性粒细胞的小中性粒细胞簇具有高弯曲系数，表明炎症微环境中的中性粒细胞趋化性。此外，还观察到中性粒细胞的定向爬行和中性粒细胞外渗。进一步对脑卒中小鼠的单细胞免疫反应进行了动态监测。随着时间的推移，在大脑一侧观察到NIR IIb信号增加，表明左大脑半球受损，这也与偏瘫的行为症状一致。中性粒细胞活化与组织浸润高度相关，组织浸润会导致炎症反应并加重缺血性中风。为了特异性追踪活化的中性粒细胞，对Ly6G和CD11b进行了双重分子靶向。在从血液循环中去除纳米探针后，确定了损伤大脑中的中性粒细胞分布。Tm-Ch和Er-Ch荧光信号的共同定位以及电感耦合等离子体质谱测量证实了中性粒细胞特异性靶向。接下来，应用双通道实时成像系统来研究通过完整头骨示踪激活的中性粒细胞。中性粒细胞的NIR IIb信号具有高达6.12的信噪比。特别是Er-Ch中的强信号表明活化的中性粒细胞表达CD11b整合素。实时图像显示活化的中性粒细胞以0.82μm/min的速度微弱地滚动和爬行 ，表明它们在内皮表面牢固粘附。此外，双色映射的中性粒细胞似乎沿着血流的剪切力被拉长，这通常被认为是中性粒细胞通过发炎血管外渗的最后一步。由于缺乏理想的NIR-IIb区中可用的荧光探针和成像技术，深层组织中的无创实时动态多重成像仍然是一个持续的挑战。开发出1632nm处荧光放大的立方相TmNP，通过调节3H4 → 3F4非辐射跃迁和BFET过程，丰富了“组织最透明”的NIR-IIb区域中可用DSNP。鉴于镧系离子丰富和梯状的能级，基于已建立的机制，预计将发现更多潜在的NIR-II发射带。DSNP固有的窄发射带，加上自制的双通道NIR-IIb荧光成像系统，实现了Tm和Er通道时空同步的实时动态多重成像。通过颅骨实时动态多重监测脑血管舒缩和中性粒细胞动力学，揭示了该技术在非侵入性血流动力学和单细胞水平免疫反应研究中的潜力。尽管已经实现了体内实时动态多重成像，但可以进一步采用NIR-IIb更高效的成像检测，纳米探针的亮度也仍需提高。有了灵敏的检测器和更明亮的DSNP，体内免疫细胞的非侵入性多重时空图谱可以进一步扩展，以增加细胞类型或标志物的数量，特别是用于在免疫复杂环境中进行研究，并实现合理的细胞治疗。Yiwei Yang, Ying Chen,
Peng Pei, et al. Fluorescence-amplified nanocrystals in the second
near-infrared window for in vivo real-time dynamic multiplexed imaging. Nat
Nanotechnol. 2023 Jun 22.https://www./articles/s41565-023-01422-2
|
