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题目：CmCNIH1 improves salt tolerance by influencing the trafficking of CmHKT1;1 in pumpkin 刊名：Plant Journal 作者：Shaowu Xue, Zhilong Bie et al. 单位：Huazhong Agricultural University, Wuhan 日期：2023 March 22    01 摘要  由于南瓜具有抗土传疾病和抗非生物胁迫的特性，因此常被用作其他葫芦科作物的砧木。南瓜砧木利用钠转运体(CmHKT1;1)有效促进Na+从茎部向根系的转运，提高接穗的耐盐性。然而，在盐胁迫反应中影响CmHKT1;1活性的分子调控机制尚不清楚。 在本研究中，一个玉米螟同源物CmCNIH1被确定为CmHKT1的潜在货物受体;酵母双杂交、生物分子荧光互补和荧光素酶互补实验表明，CmCNIH1和CmHKT1;1可以相互作用。CmCNIH1是位于内质网、内质网输出位点和高尔基体的细胞囊泡运输机制的关键组成部分。CmCNIH1基因敲除突变体比野生型(WT)对盐胁迫更敏感。此外，cmcnih1突变体的离子稳态被破坏，其茎部和根部的Na+含量高于WT, K+含量低于WT。双电极电压钳实验表明，cmcnih1不影响表达CmHKT1 - 1的细胞通过质膜(PM)的Na+电流。共定位实验数据表明，完整的CmCNIH1蛋白可以改变烟叶、南瓜根和酵母中CmHKT1;1的亚细胞定位。综上所述，CmCNIH1可能作为受体调节CmHKT1;1向PM的定位，从而提高南瓜的耐盐性。 02 技术路线  Pumpkin (Cucurbita maxima × C. moschata, Chaojiquanwang) was used in this study. Mating-based split ubiquitin system Transient expression in tobacco leaves Generation of pumpkin with transgenic roots MDA, REC, and root activity measurements Na+ and K+ measurements Functional expression of CmHKT1 and CmCNIH1 in X. laevis oocytes Ectopic expression in yeast 03 主要结果 3.1 CmCNIH1作为CmHKT1 - 1结合蛋白的鉴定 使用基于配对的分裂泛素系统(mbSUS)筛选结合CmHKT1的蛋白，以鉴定调节CmHKT1功能的蛋白;将CmHKT1;1编码区引入pBT3STE，构建诱饵载体。筛选南瓜膜蛋白文库，仅发现1个能结合CmHKT1;1的蛋白。该蛋白属于cornicon同源家族，与AtCNIH1相似度为55.48%。因此，该蛋白被命名为CmCNIH1(登录号:CmoCh07G013500，图S1)。 3.2 CmCNIH1在酵母和烟草中与CmHKT1;1发生物理相互作用 为了进一步验证CmCNIH1是否可以结合CmHKT1;1，我们通过酵母双杂交(Y2H)、荧光素酶互补成像(LCI)和生物分子荧光互补(BiFC)实验来证实这种相互作用。用pPR3N-CmCNIH1和pBT3STE-CmHKT1;1转化的酵母可以在SD/-TLHA培养基上生长，与用pTSU2-APP和pNubG-Fe65转化的酵母相似(即阳性对照)。此外，含有pPR3N(即空载体)和pBT3STE-CmHKT1;1的酵母细胞不能在同一培养基上生长。这些数据表明，CmCNIH1可以与酵母中的CmHKT1;1相互作用(图1a)。 截断CmCNIH1的CDS，根据CmCNIH1同源物的蛋白质结构进行Y2H检测。在猎物载体(pPR3N)上构建不同的截断体，包括CmCNIH1ΔN (n -末端被移除)、CmCNIH1ΔC (c -末端被移除)、CmCNIH1ΔCI (c -末端和IFRTL基序被移除)和CmCNIH1ΔCIc (c -末端、IFRTL基序和cornichon基序被移除)，进行Y2H检测以验证关键相互作用片段(图S2)。含有CmCNIH1、CmCNIH1ΔN和CmCNIH1ΔC的含酵母猎物载体的生长不如含有CmCNIH1ΔCIc和CmCNIH1ΔCI的含酵母猎物载体。 当猎物载体只含有IFRTL基序或只缺少n端时，酵母无法在SD/-TLHA培养基上生长，这表明IFRTL基序可能抑制了CmHKT1;1和CmCNIH1之间的相互作用，n端可能是相互作用的关键位置。将CmCNIH1构建到诱饵和猎物载体中，验证CmCNIH1能否形成同源体发挥其功能。然而，含有这两种载体的酵母不能在SD/-TLHA培养基上生长，这表明CmCNIH1不是通过形成同质体来发挥作用的(图S2)。 通过在烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时表达融合蛋白，采用萤火虫LCI法和BiFC法独立检测CmCNIH1与CmHKT1;1的相互作用，进一步验证CmHKT1;1与CmCNIH1是否能在植物细胞中相互作用。在LCI实验中，CmCNIH1融合到Cluc的c端，CmHKT1;1融合到Nluc的n端。2个阴性对照不发光。LCI产生的强发光表明，CmCNIH1-Cluc和CmHKT1;1-Nluc融合蛋白在植物中相互作用(图1b，右下区域)。用bic法进一步验证。当NE-CmHKT1;1与CE-CmCNIH1短暂表达时，YFP在植物细胞中积累，而阴性对照中未检测到YFP荧光，表明CmHKT1;1与CmCNIH1相互作用(图1c)。综上所述，数据明确表明CmCNIH1可以与CmHKT1相互作用;
图1 CmCNIH1与CmHKT1的相互作用 (a)采用酵母双杂交法检测CmHKT1;1与CmCNIH1之间的相互作用。以含诱饵载体和pPR3N空载体的酵母菌为阴性对照。携带pTSU2-APP和pNubG-Fe65的酵母菌作为阳性对照。SD-合成培养基，色氨酸，L-亮氨酸，H-组氨酸，A-腺嘌呤。 (b)荧光素酶互补成像实验进一步验证烟叶中CmHKT1;1-Nluc和ClucCmCNIH1之间的相互作用。 (c) CmCNIH1与CmHKT1相互作用的生物分子荧光互补实验; 3.3 CmCNIH1的序列分析 在南瓜(Cucurbita moschata var. Rifu)基因组中，在第2、3、6、7、15和16号染色体上鉴定出6个CNIH基因。CmCNIH1编码我们使用分裂泛素系统鉴定的CmHKT1;1-相互作用蛋白。CmCNIH1的编码序列为441 bp，编码146个氨基酸残基，具有4个外显子和3个内含子(图2a)。为了分析南瓜与其他物种之间的同源性，我们与来自南瓜的6个成员、黄瓜的2个成员、拟南芥的5个成员、水稻的2个成员和酵母的1个成员进行了多重序列比对。我们观察到不同物种的不同CNIH氨基酸序列之间存在显著的序列保守性(图2b)。 在许多来自植物的cnhs的c端都有一个保守的酸性结构域，它可能是与TMPs相互作用的关键结构域。此外，来自人类、小鼠和大鼠的典型cnhi被纳入系统发育树中，以说明cnhi之间的进化关系(图2c)。CmCNIH1与AtCNIH1(即来自拟南芥的CNIH1 ortholog)关系最为密切。这些蛋白也与酵母ERV14和ERV15密切相关，并形成一个大分支。AtCNIH1在拟南芥中的序列相似性较高，其空间结构和功能对于推测CmCNIH1的结构和功能具有重要意义。AtCNIH1包含一个由4个螺旋组成的“钩状”跨膜结构(图2d)。
图2南瓜家族的序列分析。 (a) CmCNIH1基因结构。 (b)来自南瓜(Cucurbita moschata)、黄瓜(Cucumis sativus)、拟南芥(Arabidopsis)、水稻(Oryza sativa)和酵母(Saccharomyces cerevisiae)的同源物的多重序列比对。下面标出了保守的酸性区域。 (c)利用MEGA 7构建其他物种CmCNIHs和cnih1样蛋白的系统进化树。 (d) AtCNIH1的预测结构。利用Alphafold2 (https://alphafold./entry/Q9C7D7)软件预测AtCNIH1的结构。 3.4 CmCNIH1在内质网、内质网出口位点(ERES)和高尔基体中聚集 Cornichon同源物主要作为货物受体，通过识别特定货物(通常是TMPs)并将其运输到特定位置，参与植物和动物细胞中COPⅠ和COPⅡ囊泡介导的细胞运输。这一过程对于内质网、高尔基体、PM和其他膜结构之间的蛋白质转运至关重要。因此，确定CmCNIH1的亚细胞定位有助于了解CmCNIH1在细胞内蛋白转运中的作用。 将CmCNIH1编码区融合到YFP编码区5 '端，利用CaMV35S启动子在具有不同细胞器标记的烟草表皮细胞中共表达CmNIH1-YFP融合蛋白(图3a-3c)。结果显示，CmCNIH1-YFP融合蛋白与ER标记物hdl - mcherry呈连续的网络结构共定位(图3a)。35S::CmCNIH1-YFP和35S::GmMan1- mCherry在烟草叶片中的瞬时共表达产生点状黄色荧光，清楚地表明CmCNIH1-YFP和高尔基体标记GmMan1- mCherry之间的重叠(图3b)。 这些数据证明CmCNIH1定位于内质网和高尔基体。COPⅱ被膜囊泡的组装发生在ER的特殊部位，称为ERES，该部位缺乏核糖体，由相互交织的管道和囊泡组成的网络。AtSec24作为ERES标记物，明确了CmCNIH1的位置和功能。AtSec24- mCherry与CmCNIH1-YFP在烟草叶片中共表达，mCherry和YFP有明显的重叠，表现为明亮的点状分布在整个细胞质中(图3c)。这一发现支持CmCNIH1介导了COP II囊泡运输。总之，共聚焦激光扫描显微镜结果表明，CmCNIH1在ER, ERES和高尔基体中聚集，提供了证据，表明CmCNIH1可能通过促进囊泡转运在ER，高尔基体和/或其他膜结构之间的蛋白质转运中发挥重要作用。
图3 CmCNIH1的亚细胞定位 (a) CmCNIH1-YFP(左)和内质网标志物hdl - mcherry(中)的表达及合并图像(右)。 (b) CmCNIH1-YFP(左)和高尔基体标记物GmMan1-mCherry(中)的表达及合并图像(右)。 (c) CmCNIH1-YFP表达(左)和ERES标记物AtSec24-mCherry(中)，合并图像(右)。 3.5 CmCNIH1基因敲除降低南瓜的耐盐性 CmHKT1;1在耐盐中起关键作用，在盐胁迫下表达上调。考虑到CmHKT1;1与CmCNIH1存在相互作用，探究CmCNIH1是否在应对盐胁迫中发挥作用。首先确定CmCNIH1的表达模式。在盐胁迫的早期阶段(盐处理后3、9、24 h)， CmCNIH1在南瓜幼苗的不同组织中表达上调，尤其是在根中，表明其在耐盐中的潜在功能(图S3)。此外，CmCNIH1在盐胁迫下的成熟叶片和生长点中高表达，表明其在响应盐胁迫中发挥着重要作用，但还有其他一些尚未揭示的机制。我们推测CmCNIH1可能通过调节CmHKT1;1的丰度和亚细胞定位，或通过影响CmHKT1;1的转运能力来促进南瓜的耐盐性，并影响南瓜细胞质基质中的Na+稳态。 为了研究CmCNIH1在盐胁迫反应中是否有功能，是否与CmHKT1;1相关，我们在CmCNIH1的第一外显子中选择了两个不同的靶点，通过CRISPR技术敲除CmCNIH1，并利用根癌农杆菌介导的转化系统获得敲除CmCNIH1的南瓜幼苗(命名为CmCNIH1 -1和CmCNIH1 -2，以下简称CmCNIH1)，用于检测南瓜根部CmCNIH1突变是否影响耐盐性。虽然未处理的野生型(WT)和cmcnih1幼苗没有显著差异，但盐处理的cmcnih1幼苗的生长受到了更严重的抑制，它们的根系MDA含量和叶片相对电导率(REC)高于盐处理的WT幼苗，根系活力低于盐处理的WT幼苗(图4a-4d)。测定茎和根的K+和Na+含量，以确定CmCNIH1对Na+从根向茎转运的影响。 未处理的cmcnih1和WT根和地上部Na+和K+含量差异不显著。在盐胁迫处理过程中，cmcnih1和WT幼苗中的Na+浓度急剧增加，cmcnih1幼苗中的Na+浓度显著高于WT，而K+浓度显著低于WT(图4e-h)。表明cmcnih1幼苗对盐胁迫的敏感性是由于根系和地上部Na+/K+平衡的紊乱所致。鉴于CmCNIH1在盐胁迫中扮演正调节因子，并与CmHKT1直接相互作用，我们下一步研究CmCNIH1是否可以增强CmHKT1的活性或影响CmHKT1的定位。
图4 CmCNIH1敲除突变体的耐盐性下降 (a)盐胁迫下野生型和cmcnih1的代表性表型。 (b) WT和cmcnih1的根系活力。 (c) WT和cmcnih1的叶片相对电导率(REC)。 (d) WT和cmcnih1的根系MDA含量。 (e)-(h) WT和cmcnih1的地上部和根部Na+和K+含量 3.7 CmCNIH1不影响CmHKT1;1的转运能力 CmHKT1;1被预测为缓解盐胁迫的Na+转运蛋白(Sun et al.， 2018)。因此，我们利用双电极电压钳(TEVC)技术分析了CmHKT1;1在细胞中的转运能力及其Na+/ K+选择性。在10 mM Na+的工作液中，CmHKT1中明显的电压门控电流激发;与对照组相比，观察到表达1的卵母细胞(图5a和b)。随后，向卵母细胞灌注不同比例的Na+和K+溶液，观察CmHKT1的离子选择性;1(图5c)。逆转电位随Na+浓度的变化而变化，但不随K+浓度的变化而变化，如图5d所示(Yao et al.， 2010)。这些数据表明，CmHKT1;1是一种主要转运Na+的I型HKT转运蛋白。 将CmHKT1;1和CmCNIH1的编码序列与tagBFP或GFP标记的编码序列进行融合，并在体外合成crna，以检测CmCNIH1是否影响CmHKT1的Na+转运活性;当仅向卵母细胞注射CmHKT1;1-BFP cRNA或以1∶1的比例与编码CmCNIH1- gfp的cRNA共注射时，CmHKT1;1-BFP蛋白明确定位于PM(图5e和f)。在卵母细胞中，CmHKT1;1-BFP可以定位于PM，而不受CmCNIH1的易化作用(图5e)。 根据CmHKT1;1- bfp表达的卵母细胞和CmHKT1;1- bfp和CmCNIH1- GFP共表达的卵母细胞中记录的电流，CmHKT1;1介导的电流幅度不受卵母细胞中CmCNIH1的影响(图5g和h)。鉴于CmCNIH1不是转运蛋白(图S4)，我们推断CmCNIH1调节CmHKT1;1 PM定位以增强对盐胁迫的耐受性。
图5 CmCNIH1对细胞中CmHKT1;1电流的影响 (a)激活CmHKT1介导的电流;以水注入卵母细胞作为对照。 (b)表达CmHKT1和不表达CmHKT1的卵母细胞的平均电压电流记录; (c)表达CmHKT1;1的卵母细胞在含不同比例Na+和K+溶液中的平均电压-电流记录。 (d) CmHKT1的逆转电位;在指示的Na+和K+溶液中1介导的电流(c)。 (e)-(f) CmHKT1的典型膜定位;(f)和(e) CmCNIH1-GFP共定位的1-BFP。 (g) CmCNIH1-GFP共表达和不共表达CmHKT1;1-BFP的卵母细胞的电流。 (h)记录的平稳电压-电流关系。 3.8 CmCNIH1改变了CmHKT1;1在植物和酵母中的pm定位 为了进一步了解CmCNIH1在分子水平上对CmHKT1;1的影响，我们构建了一系列表达融合蛋白的载体，包括CmCNIH1- mcherry、CmCNIH1- mcherry(含CmCNIH1的n端)、CmCNIH1ΔN-mCherry(去除CmCNIH1的n端)和CmHKT1;1- YFP，并利用CaMV35S启动子在烟草叶片中瞬时表达。当CmHKT1;1-YFP和CmCNIH1- mcherry共表达时，可以观察到PM发出强烈的黄色荧光，但CmHKT1;1-YFP不在PM中，表达CmHKT1时，1-YFP单独或与CmCNIH1截短体一起在细胞中随机分布(图6a)。 对PM在烟叶中的定位比例进行了统计分析。CmHKT1;1在共表达CmHKT1;1- yfp和CmCNIH1- mcherry的烟草叶片中PM定位的比例最高(80%)，而其他的比例较低，表明CmHKT1;1的定位是由CmCNIH1的结构完整性决定的。这些结果表明，CmHKT1;1可能是CmCNIH1的货物，后者有助于CmHKT1的PM定位。 进一步观察CmHKT1;1在南瓜根中的亚细胞定位。通过农杆菌介导的基因转化，获得了cmcnih1突变体，其中cmcnih1被敲除，GFP-CmHKT1;1在CaMV 35S启动子控制下表达。在WT的PM和细胞质中检测到GFP荧光，而在cmcnih1突变体中，GFP固定在细胞质中(图6b)。这一发现进一步证实了CmCNIH1可以调控CmHKT1的定位;此外，在酵母细胞中也观察到了类似的结果。 将CmHKT1;1的编码序列与黄色荧光蛋白编码序列的5 '端融合，得到CmHKT1;1- yfp融合蛋白。该融合基因在酵母株G19中表达，单独表达CmHKT1;1-YFP时，仅在细胞质中检测到少量黄色荧光。相比之下，在CmHKT1;1-YFP和CmCNIH1共表达的酵母细胞中，细胞质和PM发出的YFP荧光增加(图6c)。这些数据证明CmCNIH1可能促进了CmHKT1;1在酵母细胞PM中的积累。综上所述，CmCNIH1通过促进PM中CmHKT1;1的定位来提高耐盐性，而CmHKT1;1作为选择性Na+转运体在PM中积累.
图6 CmCNIH1促进CmHKT1;1在植物和酵母细胞的质膜中积累。 (a)左:在烟草叶片中，CmHKT1;1-YFP单独或与CmCNIH1-mCherry/CmCNIH1N-mCherry/CmCNIH1ΔN-mCherry共表达时发出的荧光。 (b) CmHKT1;1在野生型和cmcnih1突变型南瓜根中的亚细胞定位。 (c)表达CmHKT1;1-YFP并共表达CmHKT1;1-YFP和CmCNIH1的酵母株G19。  04 结论 我们提出了CmCNIH1通过促进CmHKT1;1在PM中的积累来促进南瓜耐盐的工作模型(图7)。当南瓜受到盐胁迫时，CmCNIH1在根系中的表达上调。随后，CmCNIH1的货物CmHKT1;1在细胞内转运。CmCNIH1利用其n端特异性地识别并结合CmHKT1;1，然后将CmHKT1;1从ER转运到高尔基体和/或从高尔基体转运到PM，但从高尔基体转运到PM的机制还有待研究。在PM中，CmHKT1;1作为钠转运蛋白，抑制Na+从根向茎的转运，增强南瓜的耐盐性.
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