【原】Molecular Psychiatry：抑制性中间神经元在精神疾病中的作用研究

脑声常谈 2023-07-20 发布于上海

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2023年7月13日加州大学医学院解剖学和神经生物学系Steven F. Grieco团队在Molecular Psychiatry发表论文“Anatomical and molecular characterization of parvalbumin-cholecystokinin co-expressing inhibitory interneurons: implications for neuropsychiatric conditions”，揭示了小清白胆囊收缩素共表达抑制性中间神经元的解剖学和分子特征：对神经精神疾病的影响。

抑制性中间神经元对大脑功能至关重要，它们的功能障碍与神经精神疾病有关。新的证据表明表达胆囊收缩素的中间神经元是高度异质性的。作者发现大量表达小清蛋白的中间神经元表达CCK；小鼠海马CA1中40-56%的PV+中间神经元表达CCK，灵长类动物的中间神经元也表现出大量的PV/CCK共表达。小鼠PV+/CCK+和PV+/CCK细胞表现出不同的电生理和分子特征。进行RNA测序和ATAC-seq（一种捕获染色质可及性（染色质开放性）的测序方法。）数据分析表明，PV+/CCK+细胞是PV+细胞的一个子集，而不是共触核蛋白阳性细胞的子集，它们强烈表达氧化磷酸化基因。在转录组和蛋白水平上，线粒体复合物I和IV相关的OXPHOS基因表达在转录组和蛋白水平上与CCK的表达密切相关。PV+中间神经元和OXPHOS过程的失调都与神经精神疾病有关，包括自闭症谱系障碍和神经精神疾病。

图一小鼠海马CCK+GABA能抑制性中间神经元基因靶向的交叉策略

CCK亚型及其前激素除了GABA能中间神经元外，还可以在兴奋性神经元中表达。为了仅靶向CCK+抑制性中间神经元，作者采用了交叉遗传策略， Dlx5/6驱动系限制了Dlx5/6+ GABA能抑制性神经元的表达，并排除了兴奋性神经元的表达。为了观察CCK+GABA能中间神经元，用该遗传方案标记小鼠海马CCK+ GABA能中间神经元表达，排除了CCK+兴奋性神经元。作者使用CCK和GABA免疫细胞化学染色验证了受Dlx5/6驱动系限制的CCK+细胞中GFP标记的特异性，在海马CA1、CA3和齿状回区域，CCK免疫阳性CCK&Dlx5/6-GFP标记细胞与所有CCK&Dlx5/6-GFP标记细胞的共比为96.7%。作者证实了GFP标记在小鼠海马CCK+细胞中的特异性，受Dlx5/6驱动系对CCK+ GABA能中间神经元的限制，作者发现CCK+细胞限制Dlx5/6驱动线占~30%的GABA免疫阳性细胞，表明CCK+中间神经元占~20-30%的GABA能细胞。

图二小鼠海马中CCK+和PV+抑制性中间神经元的共定位

为了检测大鼠海马中受Dlx5/6驱动限制的CCK+细胞与PV+中间神经元的共定位，对受Dlx5/6驱动系限制的CCK+细胞进行了免疫标记。同时检测了受Dlx5/6驱动系限制的CCK+细胞与其他主要神经化学神经元间标记的共定位，与其他神经元间标记相比，Dlx5/6驱动元共定位的相对频率，也显示了受Dlx5/6驱动系限制的CCK+细胞与PV+中间神经元的共定位。在S1皮层L1-6中，48%的PV+中间神经元和37%的驱动限制的CCK+细胞均为PV+和CCK+。作者量化了PV+中间神经元与小鼠海马的CCK和Dlx5/6-GFP信号在亚区和不同层的共定位程度。受Dlx5/6驱动限制的CCK+细胞和PV+中间神经元均集中在海马主细胞层中。较少的PV+中间神经元位于CA1和CA3层分子层和DG分子细胞层。许多中间神经元是PV+，并集中在CA1和CA3锥体细胞层和DG颗粒层。在小鼠海马体中有许多PV+和+共同表达的中间神经元，主要位于主细胞层，作者使用单细胞RT-PCR检测了CCK和Dlx5/6-GFP小鼠CA1 SP层GFP+细胞细胞质中Pvalb和CCK mRNA的表达水平，发现大量的中间神经元在小鼠海马中共同表达CCK和Pvalb mRNA。作者使用PV+中间神经元的单核RNA测序来确定整个海马群体中CCK mRNA的表达水平，而不仅仅是CA1。发现这些小鼠以pv细胞特异性的方式表达GFP标记的核膜，对该数据集的分析显示，小鼠总海马中大量表达pv的中间神经元也表达CCK mRNA。因此，作者使用多种互补的方法显示了PV+和CCK+在小鼠海马中共表达中间神经元的情况。

图三小鼠海马PV+/CCK+GABA能抑制性中间神经元基因靶向的交叉策略

为了研究PV+与受Dlx5/6驱动限制的CCK+细胞的共表达，特异性标记表达不同荧光蛋白组合的PV+和CCK&Dlx5/6神经元。作者通过检测海马中PV+和+间神经元群体的相对共定位来描述多标记小鼠模型。在PV-tdTomato小鼠的PV+和CCK+间神经元群体分布于CA1、CA3和DG区域。然后量化了受Dlx5/6驱动限制的共表达CCK的PV+细胞的CA1层分布。通过验证小鼠CA1层SP包含最高密度的Dlx5/6细胞还发现PV+/CCK+中间神经元存在于PV-Dlx5/6-GFP小鼠的体感桶状皮层的PV+/CCK+中间神经元。其中CCK&Dlx5/6-GFP小鼠S1区域的免疫染色显示了PV+和CCK+共同表达的中间神经元。

图四小鼠PV+/CCK+和PV+/CCK- GABA能抑制性中间神经元的电生理学

作者使用多标记的PV-td+；CCK&Dlx5/6-GFP小鼠记录PA1SP层的中间神经元，描述了不同中间神经元的电生理特性。从24个PV+/+和19个PV+/细胞中分析了电流注入诱导的动作电位。CA1中PV+/(CCK&Dlx5/6)-细胞和PV+/(CCK&Dlx5/6)+细胞的平均后超极化(AHP)值(从阈值达到负峰值的值)呈现差异趋势。作者对艾伦研究所公开发布的序列数据进行了挖掘数据，该数据集由4,270个来自成年小鼠视觉皮层的皮层GABA能中间神经元组成。鉴定了724个PV+中间神经元，基于降维的CCK+细胞显示出明显的重叠，作者对PV+/CCK+和PV+/CCK-中间神经元进行了表征，发现了PV+/ CCK+和PV+/CCK-中间神经元。这些结果表明，有一些电生理特征可以区分表达CCK的PV+中间神经元和不表达CCK的中间神经元。

图五海马表达CCK的PV+中间神经元富含氧化磷酸化（OXPHOS）基因表达

在建立PV+细胞类型和亚型后，作者分析了PV+中间神经元中CCK表达的原始转录本，发现23.3%的细胞表达至少一个CCK计数。这一表达百分比超过了93.5%的基因，超过CCK中位数表达水平的细胞分布在所有PV+中间神经元中。接下来，作者计算了PV+/CCK+和PV+/CCK细胞之间的差异基因表达，以及通过将推断的CCK表达作为连续变量计算的差异基因表达。这些分析显示了CCK共同调控基因的一个显著子集，表明在CCK表达定义的连续谱上存在显著变异。接下来，作者探究了那些与CCK共表达最大的基因。对于每种细胞类型，确定了与CCK共同上调的前10%的基因。并确定了一组104个与CCK表达密切相关的基因。作者通过计算这些基因的表达与CCK的相关性来证实这一分析，测试了与CCK共同上调基因相关的两个主要功能：嘌呤核糖核苷三磷酸合成，以及ATP代谢和氧化磷酸化的组合模块。OXPHOS是由产生ATP的复合物I-IV组成的线粒体电子传递链。为了在蛋白水平上验证这些转录组学结果，作者选择了COX6A2，在海马和皮质测序中与CCK的表达一致相关，并且高度局限于PV+中间神经元。免疫染色显示大多数PV+/CCK+细胞是COX6A2+，但大多数PV+/CCK-细胞不是COX6A2+，即PV+细胞的CCK表达与Cox6a2表达的增加密切相关。作者还发现PV+中间神经元占所有COX6A2+细胞的70%。综上，COX6A2主要在PV+/CCK+中间神经元中表达，而在PV+/CCK-细胞中不表达，而PV+/CCK+中间神经元具有独特的分子谱。

图六海马CCK表达的PV+中间神经元通过其染色质可及性特征来区分

作者通过分析从snRNA/ATAC谱获得的snATAC-seq数据，表征了野生型成年小鼠海马中PV+/CCK+和PV+/CCK-中间神经元的染色质可及性。基于降维后的UMAP聚类，由snRNA-seq分析得出的PV+神经元间细胞类型簇，并且峰值质量在不同细胞类型之间是一致的，并与已知的转录起始位点重叠。差异表达的转录起始位点（TSS）与差异表达的基因相交，这些差异表达的基因也重叠了已知的增强子/启动子区域。Dock4-Eya4、Vav3和Vipr2细胞类型显示出增加染色质可及性分别在Eya4、Vav3和Vipr2基因的TSSs处达到峰值。染色质可及性峰分析在很大程度上概括了作者通过snRNA-seq分析观察到的PV+神经元间类型，并显示在TSS上存在重要的差异表达的染色质可及性峰。已鉴定的PV+神经元间细胞类型在整个基因组中表现出不同的染色质可及性峰。PV+/CCK+和PV+/CCK-中间神经元在整个基因组中表现出不同的染色质可及性峰。作者计算了在不同的连锁评分阈值下，每种细胞类型和亚型中差异表达的连锁基因的比例。然后研究了与CCK基因相关的差异连接。在第9号染色体上，共鉴定出15个与CCK相连的连接。当将细胞细分为PV+/CCK+和PV+/CCK组时，与CCK细胞相比，所有正连接的峰值均表现出正的对数变化。Vipr2和Dock4-Chrm2均表现出较高的上调，Vipr2也显示出TSS处的可及性下降，这是转录因子结合的特征。TSS附近的几个峰主要出现在PV+/CCK+细胞中。

图七 OXPHOS基因表达的失调与精神疾病有关

以上建立了OXPHOS基因表达与PV+中间神经元小鼠海马和皮质高度相关，扩大范围OXPHOS基因表达相关的分子特征与表达其他神经元间亚类和类型。根据对特定OXPHOS基因的分析，与其他神经元间亚类相比，主要PV+间神经元间类型的OXPHOS基因表达与CCK表达最为正相关。OXPHOS基因与CCK表达在所有神经元间亚类和类型中的相关性均呈正相关。作者发现OXPHOS基因和COX/NDUF基因在PV+中间神经元和SNCG细胞中高表达程度较低，通过KEGG通路揭示许多与PV+中间神经元中CCK表达最密切相关的OXPHOS基因与神经系统疾病相关，精神分裂症和自闭症谱系障碍与CCK共同表达的多个基因有很强的相关性。作者进一步收集包括来自6个人类皮质区域的47，432个细胞。其中包括2800个PV+中间神经元，其类型分别为TAC1、WFDC、SCUB3、c8orf4、HOMER3、MF12、FAM150B、STON2、CNTNAP32和LHX6-GLP1R。大约27.5%的细胞表达至少一个CCK基因的副本，作者测试了之前在小鼠PV+中间神经元中发现的与CCK共同上调的前10%的基因，发现在人类PV+中间神经元中，许多OXPHOS基因表达与CCK的表达密切相关。作者发现在所有PV+间神经元类型中，OXPHOS基因表达与CCK表达呈正相关。精神病患者中的几个差异表达基因（COX6A1、NDUF4等）高度富集于 PV+/CCK+中间神经元。