 导语 今天给同学们分享一篇双硫死亡+分型+预后模型的生信文章“Leveraging a disulfidptosis-based signature to improve the survival and drug sensitivity of bladder cancer patients”，这篇文章于2023年5月30日发表在Front Immunol 期刊上，影响因子为8.786。  膀胱癌症（BCa）是最常见的泌尿系统肿瘤，对全球公共卫生产生重大影响。2020年，全球BCa新增病例超过57万例，死亡病例超过21万例。BCa可分为非肌肉侵袭性BCa和肌肉侵袭性BCa。虽然肌肉浸润性BCa仅占新诊断病例的30%左右，但其侵袭性、转移倾向、耐药性和高复发率导致R0切除术后肿瘤特异性生存率降低。因此，阐明BCa进展的分子机制至关重要。 1. DRGs的遗传和转录特征 首先，作者分析了BCa患者的体细胞突变情况，发现94.69%的BCa样本显示出体细胞突变（图1A）。接下来，还估计了14个DRG的体细胞突变模式（图1B）。作者的结果显示，414个BCa样本中有112个（27.05%）的DRG具有体细胞突变，主要由错义突变驱动。特别是，MYH9、MYH10、ACTB、FLNB和TLN1显示出最高的错义突变发生率，而MYH9和ACTB分别具有最高的无义突变和框内缺失发生率。为了研究14个DRG之间的相互作用，通过GeneMANIA在线工具构建了PPI网络，结果显示FLNA、MYH9、IQGAP1、CAPZB和DSTN被视为关键基因（图1C）。  图1 DRGs的遗传和转录特征 作者还分析了TCGA-BLCA队列中14个DRG的表达谱。结果显示，ACTB、DSTN、FLNA、IQGAP1、MYL6和TLN1在正常组织中过表达，而CD2AP和INF2在肿瘤组织中过度表达（图1D）。作者进一步发现，ACTB、DSTN、FLNA和TLN1在高级别和高阶段（III和IV期）BCa组织中上调，表明它们与BCa进展有关。最后，代表性的IHC图像显示了四个基因的蛋白质水平。 2. 分子亚型 为了研究DRG在BCa中的生物学作用，作者采用了无监督一致性聚类算法，根据14个DRG的表达谱对TCGA-BLCA队列的BCa样本进行分类。如CDF曲线和PAC测试所示，最佳聚类数为2。与C2相比，C1的BCa样品中DRG的表达水平更高（图2A）。就临床特征而言，C1组年龄>65岁、男性、III期和IV期患者的比例相对高于C2组（图2A）。此外，与C2患者相比，C1患者的预后较差（图2B）。  图2 基于DRG的分子亚型，具有独特的临床特征和时间景观 接下来，作者评估了免疫检查点基因（ICGs）和放化疗相关基因（CRGs）的表达水平，以及两个基于DRG的聚类之间的TIME评分。如图2C所示，CRG的SOX2、EZH2、EGFR和AKR1C1在两个基于DRG的亚型之间具有不同的表达模式。具体而言，AKR1C1和SOX2在C1中下调，而EGFR和EZH2在C1中过表达。关于时间景观，作者观察到C1的样品具有过表达的ICG（图2D）、更高的时间评分（图2E）以及更高的巨噬细胞和活化记忆CD4+T细胞的浸润水平（图2F）。然而，C2的样品具有更高丰度的调节性T细胞、活化的树突细胞、单核细胞、浸润的记忆B细胞和中性粒细胞。 3. 具有失调途径和生物过程的基于DRGs的分子亚型 为了研究两个DRG亚型之间的途径和生物过程，采用了一系列富集分析，包括GSVA、GSEA和过表达分析（ORA）。GO-BP GSVA的结果表明，DRG C1在细胞结构相关过程中富集，包括足小体组装、膜筏组装、蛋白质成熟的调节和皮层细胞骨架组织（图3A）。KEGG结果显示，DRG C1在免疫相关通路中丰富，包括局灶性粘附和NOD样受体信号通路（图3B）。GSEA随后发现DRG C1与癌症特征显著相关，包括细胞周期（G2M检查点和有丝分裂纺锤体，图3C）和癌症发生和进展（上皮-间充质转化[EMT]、缺氧和血管生成，图3D）。相反，DRG C2与代谢有关，特别是氧化磷酸化和脂肪酸代谢（图3E）。  图3 基于DRGs的分子亚型具有失调的途径和生物过程 然后，作者确定了DRG集群相关的DEG，以验证上述发现。一致地，细胞结构和免疫相关的生物过程和途径主要富集（图3F、G）。 4. BCa中与双硫死亡相关的基因亚型的检测 首先，通过单变量Cox回归分析筛选出与预后相关的DEG。然后使用分层聚类算法将BCa样本分类为三个基因亚型（图4A）。作者观察到DRG C1与基因亚型1高度相关，而C2主要与基因亚型3相关。与基因亚型3中的患者相比，基因亚型1中的BCa患者的预后更差（图4B）。此外，大多数DRG在三个基因亚型中的表达水平显著不同（图4C）。  图4 检测与二硫化物变性相关的基因亚型 5. 一种与双硫死亡相关的预后模型的开发和验证 在OS相关DEG的基础上，建立了一个具有潜在临床应用价值的双硫血症相关预后模型。TCGA-BLCA队列被用作训练集，而三个GEO数据集（GSE13507、GSE32548和GSE32894）被视为测试集。随后进行LASSO和多元Cox回归分析，构建了一个包含10个基因的模型，包括DCBLD2、JAM3、CSPG4、SCEL、GOLGA8A、CNTN1、APLP1、PTPRR、POU5F1、CTSE。每个BCa样本的DRG得分为：DRG得分=0.03458897*DCBLD2+0.03469218*JAM3+0.05195818*CSPG4+0.04814716*SCEL+0.14422347*GOLGA8A+0.02423207*CNTN1+0.09220036*APLP1+0.05143026*PTPRR+0.02817304*POU5F1+0.03568603*CTSE。 接下来，作者旨在研究DRG亚型（C1和C2）、基因亚型（1、2和3）和DRG评分之间的相关性。作者的研究结果表明，DRG C1组的DRG评分明显高于C2组。此外，DRG在高危组BCa患者中的表达更高（图4D、E）。作者还发现，基因亚型中的DRG评分遵循1>2>3的等级顺序，如图4F所示。 如风险图所示，DRG评分与较高的死亡率和较低的生存率有关（图5A）。高危组的BCa患者的OS比低风险组的患者差（图5B）。时间依赖性ROC分析显示，该模型在预测预后方面表现出色：在1、3和5年时间点的AUC分别为0.837、0.833和0.83（图5C）。  图5 双硫死亡相关预后模型的建立与验证 为了进一步验证性能，作者在三个外部验证队列中对其进行了测试。同样，在高危组的BCa患者中观察到生存率下降（图5D、F、H）。时间相关ROC分析的高AUC值也表明了所建立模型的预后表现（图5E、G、I）。 6. 免疫浸润中DRG评分的评估 通过GSEA评估高风险组和低风险组BCa样本的生物学特征。分析显示，细胞结构相关的活动，如外部包封结构组织和胶原原纤维组织，以及炎症相关的GO-BP，包括白细胞迁移、炎症反应和中性粒细胞趋化性，在高危人群中被高度激活。相反，代谢相关的生物过程，如长链脂肪酸和花生四烯酸代谢过程，在高危组中受到抑制。此外，GSEA对癌症标志物的研究结果表明，高DRG评分与细胞周期（G2M检查点和E2F靶点）、肿瘤进展（EMT、缺氧和血管生成）以及炎症和免疫（炎症反应和通过NF-kappa B的TNFA信号传递）有关。 高风险组的时间评分（包括免疫、基质和估计评分）显著升高（图S4C）。评估了免疫浸润与10个模型基因之间的相关性（图S4D）。巨噬细胞与DRG评分呈正相关，而CD8+T细胞、卵泡辅助T细胞（Tfh细胞）和Tregs与DRG得分呈负相关（图S4E）。 癌症干细胞具有自我更新、多潜能和致瘤能力，导致肿瘤生长、复发和对当前治疗的抵抗。为了评估DRG评分和CSC指数之间的关系，将两者结合起来，显示出微弱的负相关性。 7. DRG评分与ICGs和肿瘤突变负荷之间的相关性 高危组患者（52%）的TP53突变频率高于低风险组患者（45%）。此外，与低风险组患者相比，高风险组患者的TMB评分明显更高。 鉴于ICB治疗与ICG表达之间的相关性，作者接下来评估了ICG与DRG评分之间的相关性。作者的研究结果表明，大多数ICG与十个模型基因之间存在显著的负相关。具体而言，PVR、CD276和SIRPA的表达随着DRG评分的增加而增加，而TNFRSF14和CD96的表达具有相反的趋势。 8. 模型在ICB治疗的队列中的评估 作者之前的研究结果证明了DRG评分与ICG表达之间的潜在相关性。为了进一步研究作者开发的模型在免疫治疗反应中的预测能力，作者分析了三个ICB治疗的队列，包括不同类型的肿瘤。在Mariathasan队列中，高危组的预后较差（图6A）。与有应答者相比，无应答者的风险得分明显更高（图6B），与低风险组相比，高风险组的应答者比例较低，无应答率比例较高（图6C）。ROC分析显示该模型具有较高的预测性能（图6D）。此外，从免疫表型到炎症表型，风险评分逐渐降低（图6E）。  图6 该模型在预测ICB治疗组免疫治疗反应中的性能 在Braun队列中，高危组的肾细胞癌（RCC）患者的OS和PFS更差（图6F、G）。与应答者相比，无应答者的风险得分明显更高（图6H），与低风险组相比，高风险组的应答者比例较低，而无应答者比例较高（图6I）。ROC分析揭示了该模型的高预测性能（图6J）。在皮肤黑色素瘤（SKCM）患者队列中也观察到了类似的发现（图6K–O）。 9. DRG评分与CRGs及化疗敏感性的相关性 除MGMT和AKR1C1外，观察到CRG的表达与10个模型基因之间呈负相关。此外，EZH2、EGFR、TBX5和SOX2与DRG评分呈正相关。这些发现表明DRG评分可能能够预测化疗反应。为了验证这些发现，在BCa患者中使用六种常用化疗药物进行了药物敏感性分析。结果表明，高危组的BCa患者对顺铂、阿霉素、吉西他滨、甲氨蝶呤、紫杉醇和长春碱表现出耐药性。 10. POU5F1通过直接与其启动子结合反式激活CTSE 利用随机生存森林（RSF）算法来确定模型中每个基因的相对重要性。如图7A所示，POU5F1显示出最高程度的显著性，其次是CTSE、DCBLD2和GOLGA8A。作者的相关性分析表明，POU5F1仅与CTSE呈正相关（R=0.39，图7B）。此外，该结果与通过GEPIA获得的结果一致（图7C）。POU5F1，也称为OCT4，是一种与肿瘤增殖、迁移和治疗耐药性有关的转录因子。先前的研究已经深入探讨了POU5F1在各种人类癌症中的致癌表型，包括BCa。此外，Fristrup等人在一个大型多中心队列中检查了CTSE（组织蛋白酶E）的蛋白质水平，发现CTSE水平与进展到T2-T4 BCa阶段显著相关。尽管如此，CTSE在BCa中的功能作用仍知之甚少。鉴于POU5F1和CTSE之间的正相关性，作者假设POU5F1-可能反式激活CTSE以促进BCa的进展。  图7 POU5F1通过反式激活CTSE促进BCa增殖和转移 首先，作者研究了CTSE在临床BCa组织和BCa细胞系中的表达水平。在106对BCa组织中，作者观察到肿瘤组织中CTSE mRNA和蛋白质水平的上调（图7D，E），代表性的IHC图像进一步支持了这一点（图7F）。特别是，发现CTSE在BCa细胞系中过表达，特别是在5637中（图7G）。为了深入了解CTSE在BCa中的生物学功能，在5637个细胞中进行了一系列表型测定。作者使用qRT-PCR和免疫印迹分析验证了CTSE敲除的有效性（图7H）。发现CTSE缺乏可抑制5637细胞系增殖（图7I，J），以及伤口愈合迁移和transwell侵袭测定（图7K，L）。总的来说，CTSE的上调在体外驱动BCa细胞的进展。 接下来，作者研究了转录因子POU5F1和CTSE基因之间的调节机制。先前的一项研究报道了POU5F1转录结合位点的存在。然后，作者在CTSE的启动子处鉴定了POU5F1的潜在结合位点（图7M）。为了研究该结合位点的功能意义，作者在5637个细胞中进行了萤光素酶测定。作者发现POU5F1的共转染显著刺激了CTSE-WT启动子的萤光素酶活性（图7N）。此外，增加POU5F1的剂量导致荧光素酶活性的逐渐增强（图7O）。接下来，使用ChIP测定来验证POU5F1在CTSE启动子上的富集（图7M），并发现与载体组相比，外源POU5F1促进了更多POU5F1在CTSE开启子上的浓缩（图7P）。作者的结果表明，POU5F1通过直接结合其启动子来反式激活CTSE，这对mRNA和蛋白质水平都有调节作用（图7Q）。 11. POU5F1通过反式激活CTSE促进BCa增殖和转移 作者通过表型分析检测了POU5F1和CTSE之间的功能相关性，因为POU5F1-能够通过与其启动子物理结合来调节CTSE。CCK-8测定表明，POU5F1的过表达增强了5637的增殖，而缺乏CTSE则抑制了它（图7R）。在伤口愈合迁移和transwell侵入测定（图7T）中观察到类似的结果。总之，作者的研究结果表明，POU5F1通过反式激活CTSE来促进BCa细胞的增殖和转移。 总结 在这项研究中，作者全面研究了BCa中的DRG谱，并建立了一个与双硫死亡相关的预后模型，该模型在预测预后和免疫治疗反应方面表现出优异的性能。不同DRG评分的BCa样本也具有不同的时间景观、对免疫疗法和化疗的反应以及失调的途径和生物过程的特征。此外，作者发现POU5F1和CTSE是预后模型的关键组成部分。作者还进行了进一步的研究，以揭示POU5F1和CTSE之间关系的调控机制。 |
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