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本发明涉及农业技术领域，特别是涉及猕猴桃作物的防治领域，具体涉及一种猕猴桃溃疡病的综合防治方法。 技术背景 猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae,Psa)侵染引起的细菌性病害，具有潜伏性、传播速度快、防治困难等特点，已成为一种危害世界猕猴桃生产中的毁灭性病害。在生产上主要有两个发病期，第一个发病期为初春(2月下旬及3月上旬)开始发病，以危害主干、枝蔓发病为主，堵塞微管素。此后随温度升高，主干和枝蔓逐渐停止发病，叶片、花蕾和花瓣上开始发病。5月谢花期温度较高时，病害停止发展。第二个发病时期是秋季果实成熟期前后。一般在9月中下旬开始发病，主要危害秋梢叶片，主干、枝蔓很少发病。在其它时期，病原菌由于温度的原因而潜伏在植株各组织内。 在猕猴桃溃疡病的防治策略方面，由于缺乏抗性品种，目前防治措施主要以通过喷施或涂抹铜制剂和农用硫酸链霉素等广谱性杀细菌药剂来预防，但由于该病害存在部位特殊，危害方式多样，这两种防治手段防治能力有限，生产上防治效果差，不能满足猕猴桃溃疡病的防治需求。 基于猕猴桃溃疡病菌的存在部位及发生流行规律特点，采取有效的防治药剂及有针对性的施药方法将是控制该病害的关键。 在施药方式方面，传统喷雾方式仅对危害叶片的病菌有效果；涂抹也仅针对植株茎干表面的病菌有效，而茎干内部病菌则难以起到防治的作用。同时，病菌在不同温度下，其生存和繁殖能力亦有明显的差别，避开其繁殖高峰期，选择合适的施药时期，有利于病菌的清除。 基于以上问题，寻找合适的药剂及使用浓度、针对不同季节病菌主要危害特点，选择合适的施药方式和时期是防治猕猴桃溃疡病的重要因素。 在春季，猕猴桃溃疡病菌主要危害植株微管素，在针对危害微管素病害防治方面，利用注干施药技术是一种重要的施药方法。目前该技术在防治桑树萎缩病、果树黄化病、枣疯病、松树枯萎病、栎树早衰病等病害防治方面取得了显著的效果，但在防治猕猴桃溃疡病上应用较少。使用注干施药技术防治猕猴桃溃疡病时，需解决以下配套措施：一为封口问题，特别是春季的猕猴桃伤流期，根压大，气候润湿，易感染腐生细菌，需使用高强度防水型封口药泥。二为施药时期，要避开伤流期，否则易产生药液倒流现象，加速猕猴桃植株死亡。三为伤流期是病菌繁殖流行高发期，为提高效果，需在注孔里加入缓释杀细菌剂，提高药剂灭杀病菌程度。 在春季新叶长出后及秋季，猕猴桃溃疡病主要危害叶片。因此这一时期选择合适的药剂、浓度和使用时期是防治的关键。 综上所述，利用上述关键因子，寻找一种切实可行的猕猴桃溃疡病的综合防治方法，是防治猕猴桃溃疡病的重要途径。
本发明的目的是摒弃现有技术药效防治所带来的抗药性、以及注干施用方法容易产生药液倒流现象等副作用，提供一种猕猴桃溃疡病的综合防治方法。 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下： 一种猕猴桃溃疡病的综合防治方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 步骤一、前期注干施药：在前一年的11月至来年1月，进行如下两步施药： (1)同时施用四霉素和S-诱抗素的注干施药，四霉素施用浓度为75μg/mL，S-诱抗素施用浓度为10μg/mL，液量一共500mL，输液时间10d； 注干施药时，在距离树干基部6～15cm处向下倾斜45度角钻孔至树木木质部，注干深度不超过树干直径的1/2，将输液针头插入已钻树孔中进行注干； (2)随后在注孔内塞入1颗有效成分为5:1-1:5松萝酸钠和盐酸土霉素的复配缓释剂，随后封住封口。 步骤二、叶面喷雾：在来年4-5月以及9-10月，分别选用噻霉酮进行液面喷雾，喷施浓度为30-50克/公顷，4-5月和9-10月喷雾次数均为2-3次。 优选地，所述步骤一中的第(2)步，采用3-10重量％的松萝酸钠和盐酸土霉素的复配缓释剂；更优选为5％。 优选地，松萝酸钠和盐酸土霉素的重量比为3:1-1:3，最优选为1:1； 优选地，所述复配缓释剂中，包含5％的松萝酸钠和盐酸土霉素，5-25％的烷基酚聚氧乙烯醚、3-12％的聚乙烯醇，以及余量的填料，所述填料为轻质碳酸钙。 本申请缓释剂的制备方法：将配方各组分按使用比例混合，使用喷雾造粒法造粒，造粒整形后加入5mm的空心软胶囊中备用。 优选地，缓释剂配方为：5％的松萝酸钠和盐酸土霉素，8％的烷基酚聚氧乙烯醚、5％的聚乙烯醇，82％的轻质碳酸钙。 优选地，将所述复配缓释剂配制成粒径为0.1-0.3mm的颗粒，同时将该颗粒加至直径为5mm，高度为1.5cm的空心软胶囊中待用。 优选地，在步骤一中的第(2)步，采用如下高强度防水型封口药泥进行封口，所述药泥包含如下A、B两组成分： A组分为： 环氧树脂 40wt％； 邻苯二甲酸二辛酯 3.5wt％； 聚酰胺蜡 5wt％； 滑石粉 46wt％； 噻霉酮 0.5wt％； 多菌灵 5％wt％； B组分为： 聚酰胺固化剂 45wt％； 滑石粉 40wt％； 碳酸钙 10wt％； 邻苯二甲酸二辛酯 5wt％； 采用所述药泥封口时，将A和B成分按重量比1：1混合均匀后涂抹于注孔处。 本申请高强度防水型封口药泥的制备方法：将A和B分别按配方混合，使用多功能搅拌器分别进行搅拌均匀，再将A和B组分密封保存。 除非另有说明，本说明书中的“％”均为“重量百分比”。 本发明针对猕猴桃溃疡病的存在部位和危害特点，抓住病菌的休眠期，利用注干施药和喷雾施药相结合的方式，系统清除病原菌危害，具有可持续防控溃疡病的作用。且选择药剂作用机理多样，有效避免了病菌抗药性的产生。 本发明在传统注干施药措施的基础上，添加了注孔填充缓释剂和封口措施，增加了药剂的持续防控能力，有效避免了猕猴桃伤流期不能施药，导致防治效果不理想的问题。 本发明研制的缓释剂具有双重缓释的作用，使药剂释放更加缓慢，进一步提高了药剂的持效性。 进一步地，本发明研制的封口药泥具有强度高，疏水性强，具有兼治多种腐生细菌和真菌的作用，解决了猕猴桃伤流期根压大，植株体液外渗严重，常规封口剂难以封口的问题，且能有效解决伤口感染。 生物实施例 一、防治猕猴桃溃疡病的药剂筛选 1.方法 1.1药剂初筛 采用抑菌圈法，将猕猴桃溃疡病菌株移到LB固体培养基上活化培养，再进行扩大培养，之后用无菌水配置成浓度为106～107cfu/mL的菌悬液。在每个直径为9cm的培养皿中倒入约10mL融化的固体LB培养基，摇匀后制成平板，取50μL菌悬液均匀的涂布在冷却的LB平板上。将18种试验药剂的质量浓度均稀释成2.5mg/mL，在每个培养皿中各放置3个已灭菌的牛津杯，取各供试药剂200μL分别加入各皿的牛津杯中，设置空白对照(CK)，28℃恒温培养箱中培养48h，观察牛津杯周围有无明显的抑菌现象，以确定室内毒力测定的待测药剂，试验重复3次。 1.2试验药剂的最低抑菌浓度的测定 借鉴赵凌旭的肉汤稀释法，对初筛结果中抑制猕猴桃溃疡病菌效果最好的5种单剂农药进行最低抑菌浓度测定。先将5种试验药剂均稀释10倍待用。然后取灭菌试管13支，排成一排，除第1管加入9mLLB培养基外，其余每管加入LB培养基5mL，在第1管加入抗菌药物1mL混匀，然后吸取5mL至第2管，混匀后再吸取5mL至第3管，如此连续倍比稀释至第12管，并从第12管中吸取5mL弃去，第13管为不含药物的生长对照。然后在每管内加入菌悬液各1mL，用试管塞封口，置于28℃培养箱中黑暗培养。72h后肉眼观察，以完全抑制菌落生长的最低药物浓度作为该药剂对猕猴桃溃疡病病原菌的最低抑菌浓度(MIC)。 1.3试验药剂的室内毒力测定 采用浑浊度法，将初筛结果中抑制猕猴桃溃疡病菌效果最好的5种单剂农药进行毒力测定，以硫酸链霉素作为对照药剂。将各试验药剂的质量浓度配比成5个浓度梯度，将活化的菌种用灭菌水稀释为1×107cfu/mL菌悬液。然后向每个50mL灭菌锥形瓶中加入20mLLB液体培养基和1mL菌液，吸取1mL各浓度试验药剂加入相应的锥形瓶中。以只含LB液体培养基和菌液作空白对照，各处理设3个重复。将其混匀后，测定各处理的浑浊度并记录数据。然后将各处理置于28℃～30℃，120r/min的条件下振荡培养12h，待空白对照处理达到对数生长期时，测定各处理的最终浑浊度。以硫酸链霉素为对照药剂，比较其与各试验药剂的抑菌性能。由于浑浊度的变化值ΔA与细菌的生长量成正比，按以下公式计算试验药剂对猕猴桃溃疡病菌生长量的抑制率。 其中，P为抑菌生长率，A0为空白对照浑浊度增加值，A1为药剂处理浑浊度增加值。将抑制率转换为几率值，求出供试药剂浓度的对数值，用最小二乘法计算抑菌几率值与供试药剂浓度对数的毒力回归方程式，求出EC50、EC95及其95％置信限。 2.结果 2.1试验药剂初筛结果 采用抑菌圈法对18种市场上常用杀细菌剂进行初筛，确定室内毒力待测药剂。结果表明：在相同有效成分含量的情况下，四霉素对猕猴桃溃疡病菌的抑菌效果最好，抑菌圈为7.28cm，噻霉酮其次，抑菌圈为5.61cm；松萝酸钠、乙蒜素、盐酸土霉素、氢氧化铜、链霉素和中生菌素6种杀菌剂对病菌有一定的抑菌作用；但噻唑锌、新植霉素、噻菌铜等10种杀菌剂无明显的抑菌作用(见表1)。 表1猕猴桃细菌性溃疡病防治药物初筛结果 注：－表示无抑菌作用；++表示透明；+表示半透明 2.2试验药剂最低抑菌浓度的测定结果 根据试剂初筛结果，选出5种抑菌效果最好的药剂，分别是四霉素、噻霉酮、松萝酸钠、盐酸土霉素和乙蒜素，测定其最低抑菌浓度值(MIC)，结果见表2，由表2可知，四霉素MIC值为16.25mg/L；噻霉酮MIC值为40.6250mg/L；而松萝酸钠、盐酸土霉素和乙蒜素均从第4号试管开始出现菌落生长，其MIC值均大于150mg/L。 表2猕猴桃溃疡病防治药剂的最低抑菌浓度 2.3试验药剂的室内毒力测定结果 采用浑浊度法分别测定了四霉素、噻霉酮、松萝酸钠、盐酸土霉素、乙蒜素的毒力。结果表明：四霉素对猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌效果最好，其EC50值最小，为3.1743mg/L，而噻霉酮、松萝酸钠、盐酸土霉素和乙蒜素的EC50值介于10～30mg/L之间(见表3)。 通过以上试验，综合考虑后选用四霉素、噻霉酮、松萝酸钠和盐酸土霉素作为防治猕猴桃溃疡病的药剂。 表3 5种药剂室内毒力测定结果 二、四霉素注干应用技术 1.方法 1.1试验设计 试验于2014年8月至2015年4月在四川省都江堰市驾虹乡新民村进行，猕猴桃试验品种为红阳，树龄8-10年，溃疡病发生严重，土壤肥力中等。选择四霉素作为田间药效试验药剂。田间试验采用单因素随机区组设计，设施药时期、药剂浓度和施药部位处理，每处理3次重复，每个重复10株。 施药时期处理：将四霉素稀释成75μg/mL，分别于2014年8月、10月和12月3个不同时期进行猕猴桃木质部注射施药，输液量为500mL。 施药浓度处理：在2014年12月，将四霉素分别稀释成37.5μg/mL、75μg/mL、150μg/mL 3个浓度进行猕猴桃木质部注射，输液量为500mL。 施药部位处理：将四霉素分别稀释成75μg/mL，在2014年12月将药剂分别注射到木质部和韧皮部，输液量为500mL。 1.2调查方法 从猕猴桃溃疡病春季发病期即2015年2月下旬开始到3月下旬，每隔10d分别逐株调查各处理所有猕猴桃的枝条发病情况，4月初调查叶片发病情况，记录发病株数和发病程度，计算发病株率、病情指数及相对防效。病害分级标准见表4。 表4猕猴桃枝条溃疡病的分级标准(枝条) 表5猕猴桃叶片溃疡病的分级标准(叶片) 2.结果 2.1不同稀释浓度结果 由表6可知，四霉素注干的不同质量稀释浓度对猕猴桃溃疡病的相对防治效果有显著差异(P<0.05)，其中稀释成150μg/mL和75μg/mL的药液的猕猴桃溃疡病发病株率低，防治效果高，与稀释成37.5μg/mL的药液相比，差异显著。但不同浓度处理对叶片发病均没有表现出很好的防治效果。因此选用四霉素75μg/mL为注干最佳浓度。 表6药剂不同稀释浓度的树干注射试验结果(枝条) 表7药剂不同稀释浓度的树干注射试验结果(叶片) 2.2不同施药时期试验结果 通过对田间3个不同注干施药时期试验进行猕猴桃枝条和叶片发病情况的连续调查，结果见表8和表9。结果表明，在12月份对猕猴桃进行注干施药防治溃疡病的效果最好，其中对枝条的相对防效为81.10％，对叶片的相对防效为64.29％，与8月份注干施药的相对防效具有显著差异(P<0.05)。但仍表现为对茎干的防治效果要远高于叶片防治效果。因此选择12月为最佳施药时期。 表8不同树干注射施药时期的试验结果(枝条) 表9不同树干注射施药时期的试验结果(叶片) 2.3不同注射部位试验结果 由表10和11可知，用四霉素分别注射猕猴桃木质部与韧皮部对溃疡病的相对防效存在显著差异(P<0.05)，其中注射木质部的发病株率最低，对猕猴桃枝条的相对防效达到93.75％，对猕猴桃叶片的相对防效为42.86％；而注射韧皮部的猕猴桃枝条发病株率高，相对防效仅为62.5％，对叶片几乎无防治效果。 表10不同树干注射施药部位的试验结果(枝条) 表11不同树干注射施药部位的试验结果(叶片) 三、松萝酸钠和盐酸土霉素复配缓释剂的研制 1.方法 1.1松萝酸钠和盐酸土霉素最佳配比的筛选 将松萝酸钠和盐酸土霉素进行复配：将两种原药按有效成分配制成5:1，3:1，1:1，1:3，1:5共5个配比(质量比)。上述配方分别按药剂毒力测定方法(浑浊度法)进行毒力测定。 对混剂联合作用进行评价，以EC50值为基础，通过计算混剂共毒系数评价混剂联合作用类型。 选取其中的A药剂为标准药剂，各药剂毒力指数按以下公式计算： 混剂理论毒力指数(TTI)＝PA×A+PB×B 其中PA,PB分别为混剂中两种原药的百分含量，A,B分别为两种原药的毒力指数。 CTC≥170为明显增效，120≤CTC<170为略有增效，70≤CTC<120为相加作用，5CTC<70为拮抗作用。 1.2复配缓释剂的田间应用效果 试验在四川省都江堰市驾虹乡新民村进行，猕猴桃试验品种为红阳，树龄8-10年，溃疡病发生严重，土壤肥力中等。于2015年1-2月，在距离树干基部10cm处向下倾斜45度角钻孔至树木木质部，注干深度不超过树干直径的1/2，将研制的3％松萝酸钠和盐酸0土霉素缓释剂、5％松萝酸钠和盐酸土霉素缓释剂、7％松萝酸钠和盐酸土霉素缓释剂和10％松萝酸钠和盐酸土霉素缓释剂塞入注孔中，封口；以注孔后封口为对照。于猕猴桃溃疡病春季发病初期即2015年2月下旬开始到3月下旬，每隔10d分别逐株调查各处理所有猕猴桃的枝条发病情况。田间试验采用单因素随机区组设计，每处理3次重复，每个重复10株。 3％松萝酸钠和盐酸土霉素缓释剂配方：1.5％的松萝酸钠，1.5％盐酸土霉素，8％的烷基酚聚氧乙烯醚、5％的聚乙烯醇，84％的轻质碳酸钙。 5％松萝酸钠和盐酸土霉素缓释剂配方：2.5％的松萝酸钠，2.5％盐酸土霉素，8％的烷基酚聚氧乙烯醚、5％的聚乙烯醇，82％的轻质碳酸钙。 7％松萝酸钠和盐酸土霉素缓释剂配方：3.5％的松萝酸钠，3.5％盐酸土霉素，8％的烷0基酚聚氧乙烯醚、5％的聚乙烯醇，80％的轻质碳酸钙。 10％松萝酸钠和盐酸土霉素缓释剂配方：5％的松萝酸钠，5％盐酸土霉素，8％的烷基酚聚氧乙烯醚、5％的聚乙烯醇，77％的轻质碳酸钙。 2.试验结果 2.1松萝酸钠和盐酸土霉素最佳配比的筛选 由表12可以看出，松萝酸钠和盐酸土霉素5不同配比的共毒系数均大于120，均表现出增效作用。其中，当配比为1：1时，其共毒系数最大，为165.27，因此，优选选用松萝酸钠和盐酸土霉素质量比为1：1为缓释剂的有效成分配比。 表12松萝酸钠和盐酸土霉素对猕猴桃溃疡病菌的配比筛选结果 2.2复配缓释剂的田间防治效果 由表13可以看出，不同有效成分含量的缓释剂对猕猴桃溃疡病均有一定的防治作用。其中，当有效成分含量在5％及以上时，最终防治效果相当，因此选用5％为缓释剂的有效成分含量。 表13不同含量复配缓释剂对猕猴桃溃疡病菌的田间防治效果 四、猕猴桃溃疡病综合防治技术 1.方法 1.1试验设计 试验在四川省都江堰市驾虹乡新民村进行，猕猴桃试验品种为红阳，树龄8-10年，溃疡病发生严重，土壤肥力中等。 综合防治技术为：在2015年11月-2016年1月，使用四霉素加S-诱抗素注干施药，四霉素药液使用浓度为75μg/mL，S-诱抗素浓度为10μg/mL，装液量500mL，输液时间10d。输液结束后，在注孔内塞入5％松萝酸钠和盐酸土霉素复配缓释剂，再选用高强度防水型封口药泥封口。在2016年4月-5月及9月-10月，选用噻霉酮进行叶面喷雾，喷施浓度为50克/公顷，喷雾次数3次。 以在2015年11月-2016年1月，输入清水，装液量500mL，输液时间10d，输液结束后选用高强度防水型封口药泥封口，为CK0； 以在2015年11月-2016年1月，单独使用四霉素75μg/mL，装液量500mL，输液时间10d，输液结束后选用高强度防水型封口药泥封口，为CK1； 以在2015年11月-2016年1月，单独使用S-诱抗素浓度为10μg/mL，装液量500mL，输液时间10d，输液结束后选用高强度防水型封口药泥封口，为CK2； 以在2015年11月-2016年1月，单独使用农用硫酸链霉素75μg/mL，装液量500mL，输液时间10d，输液结束后选用高强度防水型封口药泥封口，为CK3； 以在2016年1月-2月，单独使用松萝酸钠和盐酸土霉素复配缓释剂塞入孔洞，随后选用高强度防水型封口药泥封口，为CK4； 以在2015年11月-2016年1月，使用四霉素加S-诱抗素注干施药，四霉素药液使用浓度为75μg/mL，S-诱抗素浓度为10μg/mL，装液量500mL，输液时间10d。输液结束后，在注孔内塞入5％松萝酸钠和盐酸土霉素复配缓释剂，再选用高强度防水型封口药泥封口，为CK5； 以在2016年4月-5月，选用噻霉酮进行叶面喷雾，喷施浓度为50克/公顷，喷雾次数3次，为CK6； 以在2016年9月-10月，选用噻霉酮进行叶面喷雾，喷施浓度为50克/公顷，喷雾次数3次，为CK7； 以在2016年4月-5月及9月-10月，选用噻霉酮进行叶面喷雾，喷施浓度为50克/公顷，喷雾次数3次，为CK8。 以在2015年4月-5月及9月-10月，选用四霉素进行叶面喷雾，喷施浓度为50克/公顷，喷雾次数3次，为CK9。 以在4月-5月及9月-10月，喷施清水为CK10。 1.2调查方法 从猕猴桃溃疡病春季发病期即2016年2月下旬开始到3月下旬，每隔10d分别逐株调查各处理所有猕猴桃的枝条发病情况。于2016年4月和9月叶片喷雾施药前调查叶片发病情况，在叶片喷雾第三次施药后7天记录叶片发病程度，计算发病率、病情指数及相对防效。 2.结果 2.1综合防控技术防治猕猴桃溃疡病效果(枝条) 由表14可以看出，使用综合防控技术后，对猕猴桃溃疡病的茎干和枝条危害有长时期显著的控制作用，在不同时期其防治效果均为100％；单独使用四霉素注干(CK1)，其最终防治效果76.81％；单独使用S-诱抗素注干(CK2)，其最终防治效果仅为13.59％；单独使用农用硫酸链霉素注干(CK3)，其最终防治效果为48.97％；单独使用松萝酸钠和盐酸土霉素复配缓释剂树体埋药(CK4)，其最终防治效果为75.07％；而使用四霉素加S-诱抗素注干及在注孔内塞入5％松萝酸钠和盐酸土霉素复配缓释剂(CK5)，其在不同时期其防治效果均为100％；而单独使用四霉素喷雾(CK9)，对猕猴桃枝干几乎无防治效果。 表14综合防控技术防治猕猴桃溃疡病效果(枝条) 2.2综合防控技术防治猕猴桃溃疡病效果(叶片) 由表15可以看出，使用综合防控技术后，对猕猴桃溃疡病的叶片危害有极其明显的防治作用，防治效果达到88％以上。而单独使用注干或树体埋药技术，均不能对叶片上猕猴桃溃疡病菌起到明显的防治效果。药剂喷雾防治效果理想，但不能对枝干的猕猴桃溃疡病菌起到防治作用。 根据以上试验结果，表明综合防控技术对猕猴桃枝干及叶片上的溃疡病菌均有显著的防治作用。 表15综合防控技术防治猕猴桃溃疡病效果(叶片) 本发明的一种猕猴桃溃疡病的综合防治方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。 |
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