  研究背景 缺血性心脏病是威胁全球人民生命健康的沉重负担，是最危险的心血管不良事件之一，主要由心肌梗死 (MI) 引发，可对心肌造成不可逆的损伤。哺乳动物心脏的自我修复能力有限，不足以实现功能重建。因此，探索改善心脏修复的潜在策略是当下心血管领域的研究热点和难点。LPA是一种内源性生物活性小分子，可通过其广泛表达于细胞膜表面的受体LPA1-6发挥细胞增殖、迁移和分泌等功能，进而参与机体发育，以及疾病发生和发展。然而LPA受体2（LPA2）在心脏缺血损伤中的作用，尚无研究报道。 研究目的 本研究关注在LPA2在心梗后病理过程中的调节作用及机制，通过构建LPA2基因全身和内皮细胞特异性敲除小鼠，使用新生和成年小鼠心梗、下肢缺血损伤模型，并结合原代细胞体外实验，明确LPA-LPA2信号对心脏缺血损伤修复的影响；此外，借助腺病毒过表达和激动剂介导的药物活化，初步探讨了LPA2作为临床干预治疗靶点的转化应用价值。 研究方法 【基因工程鼠】 本研究用到了2种基因工程鼠，分别是LPA2基因全身和内皮细胞特异性敲除的小鼠。前期我们为研究LPA2作用，做了全身敲除小鼠来验证其功能，表型可能会更明显，构建费用较少；但随着研究深入，我们判断LPA2可能主要作用在血管内皮细胞，为证实此假设，再次构建内皮细胞特异敲除小鼠。目前，随着研究技术的进步，可以做到细胞类型、时间等方面特异性敲除的在体研究，达到更加精准的研究目的。 【动物模型】 本研究构建了2种小鼠模型，分别为（新生和成年）心肌梗死小鼠模型和小鼠下肢缺血损伤模型。 1）心肌梗死小鼠模型：结扎冠状动脉左前降支，新生和成年小鼠模型的具体方法可参考https://pubmed.ncbi.nlm./24434799/和https://pubmed.ncbi.nlm./26330161/。操作要点为：新生乳鼠的麻醉，结扎（新生乳鼠冠脉可见）和术后加热垫苏醒；成年鼠的麻醉选择和剂量，以及呼吸（如开关胸时胸肌的分层叠加以避免气胸）和结扎位置（成年小鼠冠脉较难看到，可参考心大静脉和心耳位置做结扎）。 2）小鼠下肢缺血损伤模型：结扎左股动脉（从股动脉分叉远端到隐动脉），具体方法可参考https://pubmed.ncbi.nlm./28154007/ 。操作要点为：小鼠股动脉、静脉和并行神经分离的显微操作，以及结扎位置的一致性。 【原代细胞体外实验】 本研究共涉及4种小鼠原代细胞，对应的目的分别如下：  【干预手段】 2种，分别是腺病毒过表达LPA2和LPA2特异性激动剂。 研究结果 1. 关注来源：心肌梗死后小鼠血清溶血磷脂酸 LPA和心脏Lpar2表达水平上调 首先，我们利用心梗模型发现梗死小鼠的血清中LPA以及心脏中的LPA2表达增加（图1A-D）。其次，通过分离原代大鼠心肌细胞、成纤维细胞以及内皮细胞，缺氧刺激以及LPA处理后发现LPA2主要在内皮细胞表达增加（图1E, F）。并且心梗后，LPA2也是主要在内皮细胞表达增加（图1G）。此外，我们在病人的血管中也检测到了LPA2的表达（图1H）。以上结果表明心梗后，LPA-LPA2信号被激活。  图1 2. 敲除作用探索：LPA2 敲除恶化心梗后小鼠存活、心脏功能、重塑和心脏再生 随后，利用LPA2敲除小鼠，我们比较了成年对照鼠和敲除LPA2小鼠的存活率（图2A，B）、心功能（图2C，D）、纤维化（图2E）以及心脏再生（图2F）等情况。此外，我们利用超声（图2G，I）、Masson染色、天狼星红染色（图2H）以及免疫荧光染色（图2J）等检测对比了新生对照鼠和敲除LPA2小鼠。结果显示敲除了LPA2的成年及新生小鼠的存活率、心功能、心脏重塑情况以及血管再生情况都有所恶化。  图2 3.可能机制：LPA2 是血管生成所必需 利用小鼠下肢缺血模型，我们进一步验证LPA2在血管新生中的作用。结果显示，LPA2敲除后，下肢缺血后的血流恢复受损（图3A,B），腓肠肌间血管密度有所减少（图3C,D）。此外，体外实验中，LPA2缺失的内皮细胞的成管能力（图3E,F）以及迁移能力（图3G,H）都有所下降。以上结果表明，敲除LPA2可损害血管新生作用（图3）。  图3 4. 早期死亡表型：LPA2缺陷破坏内皮稳态导致心梗后早期急性死亡 此外，我们还关注到LPA2缺失小鼠心梗后早期的急性死亡表型（图2B），所以进一步研究了LPA2在早期心梗中的作用（研究设计见图4A）。利用TTC染色评估心肌缺血面积（图4B）、超声评估心脏收缩功能（图4C）、ELISA测量血浆乳酸脱氢酶浓度（图4D）、免疫组织化学/荧光染色评估细胞凋亡程度（图4E）、免疫细胞浸润水平（图4F）、血管渗漏（图4G,H），并通过CCK8实验和AV/PI染料分别评估了内皮细胞的活性和凋亡水平（图4I,J），我们发现LPA2敲除会影响心梗早期小鼠的血管稳态。而血管稳态的改变可造成血管渗漏的增加，这可能是造成心梗后小鼠早期急性死亡的重要原因。  图4 5.条件敲除验证：内皮 LPA2 通过缺血性损伤后的血管生成维持组织修复 以上结果提示LPA2主要在内皮细胞中发挥作用，我们构建了LPA2特异性内皮细胞敲除小鼠去研究其功能（图5A）。结果发现，内皮细胞特异性敲除LPA2小鼠在心梗后的存活率大大下降（图5B）、梗死面积显著增加（图5C）。此外，该敲除鼠的心功能（图5D）、心脏重塑以及血管新生（图5E,F）也出现恶化。在下肢缺血损伤模型中，LPA2特异性内皮细胞敲除小鼠的血流恢复也受到明显抑制（图5G）。此外，心梗后第三天，LPA2特异性内皮细胞敲除小鼠的心肌组织中免疫细胞（局势细胞和中性粒细胞）浸润高于对照小鼠（图5H,I）。以上结果提示，内皮细胞特异性敲除LPA2可通过减少血管新生从而加剧心梗后心脏损伤和心功能的恶化。  图5 6.体外机制探索：LPA2在LPA诱导的内皮细胞增殖和成管中起关键作用 为了进行体外细胞机制研究，我们分别分离了LPA2敲除鼠和对照鼠的血管内皮细胞。结果发现，LPA可通过LPA2活化Raf1-ERK以及PI3K-Akt信号来调节内皮细胞的增殖（图6A-F）。此外，LPA还可通过LPA2介导的PKD1-CD36-VEGFR2通路来调节内皮细胞的成管和迁移（图6G-H）。  图6 7.转化价值：LPA2功能的获得改善心肌梗死后的心功能和恶性重塑 最后，为了探究LPA2是否可以作为心梗治疗的潜在靶点。我们通过腺病毒介导LPA2过表达（图7A-E）或者利用LPA2的特异性激动剂DBIBB（图7F-K），均可改善心梗后的心功能，而这一作用主要与促进血管新生以及维持血管稳态等作用有关。  图7 结论与展望 综上所述，LPA2可通过改善血管稳态、促进血管新生、减轻血管渗漏等机制改善心肌梗死后的心脏重塑作用，从而提高心功能，有望成为缺血性心脏病的重要潜在治疗靶点（图8）。  图8 个人感想 本研究周期较长，最初因为要毕业，2020年初论文直接投稿至Circulation Research，后因全球新冠疫情肆虐，编辑考虑到可能来不及及时补实验回复，最终给了重投。经历了半年之久的“疫情长假”，博士毕业答辩和博后入站，课题方向与精力调整，以及条件敲除小鼠的构建及实验摸索和开展，2022年3月初终于完成所有意见要补及自认为必要的实验，再次送审后回复审稿人均无意见。文章并未尝试其他杂志，虽然当时心想存亡72小时很快，不行就换期刊，只要能毕业，但依然感谢老板的坚持。 课题的开展与完成，大多为一个人苦寂的修行，感谢那些奔波于实验室，单调而又充实的日夜。 惟将终夜长开眼，无关乎发量与身形。 作者寄语 个人能力有限，科研需要思维火花的碰撞，热忱期待交流讨论！ 作者简介 裴建秋，北京协和医学院2015级生物化学与分子生物学专业直博生，2020年8月至2022年11月于郑哲教授课题组开展博士后工作。喜好疾病动物模型学习和手术操作，主要研究方向为-心脏缺血损伤后的修复再生与重构。参与多项课题研究，发表SCI论文多篇，以第一/共同第一作者发表SCI研究论文3篇，其中Q1区2篇，获批发明专利一项。 下面为大家总结了本研究涉及的科研知识相关视频，有兴趣可点击观看，希望能对大家的科研有所帮助~ |
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