Nature综述热点：肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子(TNF)是炎症反应的核心细胞因子，中和TNF的生物制剂是治疗慢性炎症和自身免疫病变的最成功药物之一。近年来研究发现，TNF不仅可以通过直接诱导炎症基因表达来驱动炎症反应，还可以通过诱导细胞死亡、激发炎症免疫反应和疾病发展来间接驱动炎症反应。因此，细胞死亡抑制剂被认为是治疗TNF依赖性炎症性疾病的新方法。今天给大家介绍一篇2022年11月15日发表在Nature reviews, Immunology(IF: 108.555)的综述，这篇文章详细介绍了TNF在炎症过程中的作用。

一、研究背景

细胞死亡越来越被认为是炎症疾病的主要驱动因素。与通常被认为是免疫沉默的细胞凋亡相比，细胞死亡的裂解形式（如坏死性凋亡、焦亡和凋亡驱动的继发性坏死)会释放细胞内因子，激活免疫受体和诱导炎症反应。细胞死亡以其多种形式作为炎症的起始或放大因素。然而，死亡并不是细胞的默认反应，除非某些细胞死亡检查点被覆盖，否则通常会被抑制。

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越来越多的证据表明，在各种急慢性炎症性疾病的小鼠模型中，阻断细胞死亡可以逆转炎症病理状态。因此需要进一步了解各种细胞死亡模式之间的相互作用，它们的执行模式，控制它们的分子检查点，以及关闭它们的生理和病理条件，从而确定新的治疗靶点。炎性细胞因子肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor , TNF)是协调炎性免疫反应的核心。因此，TNF中和疗法在慢性炎症和自身免疫病理的治疗中非常成功。

这篇综述简要回顾了TNF作为治疗靶点的历史和发现，然后重点关注TNF通过诱导细胞死亡间接促进炎症的最新发现。因此，直接抑制细胞死亡被认为是治疗TNF介导的疾病的一种新的治疗策略，特别是对抗TNF治疗无效或出现不良反应的患者。

二、主要结果

1.TNF的简史

TNF被确定为一种血清因子，可以诱导急性细菌感染后的病人出现肿瘤的出血性坏死（图1）。纽约外科医生William Coley在近一个世纪前就已经利用了这种抗癌活性。后来，从细菌提取物中分离出脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，并在小鼠的实验性癌症研究中显示能诱发一些肿瘤的消退。Carswell等人后来证明，杀死癌细胞的不是LPS本身，而是宿主巨噬细胞对LPS产生的一种坏死因子。因此，这种坏死因子被命名为 "肿瘤坏死因子 "或 "TNF "。在此后的几年里，编码人类和小鼠TNF和TNF受体的基因被纯化、测序和克隆，并开始用重组TNF进行实验研究，以验证其治疗癌症的抗肿瘤潜力。然而，当重组细胞因子给药会诱发严重的内毒素休克时，TNF成为一种强大的抗癌药物的希望就破灭了。事实上，在这些癌症研究之外，TNF被发现与先前确定的一种名为 "cachectin "的蛋白质相同，后者负责内毒素诱导的小鼠消耗性疾病(cachexia)（图1）。这些发现表明，TNF是一种必须受到严格调控的多态性细胞因子。

图1. TNF和TNF诱导的细胞死亡历史中关键事件的时间轴

2.TNF诱导细胞死亡

抗TNF生物制剂治疗炎症性疾病的临床成功归因于其可有效阻断TNF与其同源受体TNF受体1 (TNFR1)和TNFR2的结合。长期以来，人们认为这种阻断可通过阻止TNFR1激活MAPK通路和NF-κB通路来减轻炎症，否则这些通路将共同导致构成炎症病理基础的促炎基因的转录上调(图2)。现在已经明确，TNF与TNFR1的结合也通过诱导细胞凋亡、坏死性凋亡或细胞焦亡的形式间接促进和加重炎症。事实上，死亡细胞释放的细胞内成分可诱导邻近细胞的促炎基因表达。此外，上皮细胞死亡(皮肤或肠道内)可能影响屏障完整性，诱导微生物组织浸润和炎症(图2)。因此，在TNF诱导的炎症性疾病的各种小鼠模型中，细胞死亡的遗传靶向被证明可逆转炎症表型。因此，目前正在研究抑制细胞死亡的药物，如受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (RIPK1)抑制剂，作为TNF驱动的人类疾病的替代疗法。

图2. TNFR1介导的炎症信号

虽然TNFR1有能力引发细胞死亡，但这种反应只有在其中一个细胞死亡检查点失活时才会进行（图3）。TNFR1激活的生存与死亡结果取决于两个不同的、但连续的蛋白复合物的组装（图3）。膜结合的复合物I在TNF感应的几秒钟内形成，并主要导致炎症基因的激活。复合物I的组装始于RIPK1和TNFR1相关死亡域蛋白（TRADD）与受体的细胞膜部分的结合，允许随后招募TNFR相关因子2（TRAF2）和泛素连接酶细胞凋亡抑制因子1（cIAP1）、cIAP2和线性泛素链组装复合物（LUBAC；由HOIL1、HOIP和SHARPIN组成）。这些E3连接酶共同产生了一个密集的泛素链网络，允许进一步招募激活MAPK信号途径的激酶和典型的NF-κB信号途径。与复合物I相关的泛素网络受到一组去泛素化酶的负向调节，包括A20、CYLD和OTULIN，它们破坏信号复合物的稳定性，并将信号限制在MAPKs和NF-κB上。

TNFR1信号如何进一步发展以诱导细胞死亡还不太清楚，但它需要组装一个二级细胞膜复合物，称为 "复合物II"，它源于FAS相关死亡域蛋白（FADD）与受体相关复合物I成分TRADD和/或RIPK1的结合。复合物II的功能是作为细胞膜平台，用于结合和激活caspase 8，caspase 8可以处理下游效应caspase以诱导细胞凋亡，或者转而裂解gasdermin D (GSDMD)以触发热凋亡。到目前为止，已经发现有两个细胞死亡检查点可以抑制这些死亡复合体诱导的细胞凋亡。第一个（"IKK检查点"）发生在受体水平，在复合物I内，包括IKKα-IKKβ和TBK1-IKKε对RIPK1的磷酸化依赖性失活，从而阻止复合物IIb的组装和随后RIPK1激酶活性依赖性凋亡的诱导（图3）。第二个细胞死亡检查点（"NF-κB检查点"）发生在该途径的下游，在细胞核中，并依赖于NF-κB依赖的转录和翻译上调的促生存蛋白。由于IKKα和IKKβ是典型的NF-κB途径的上游激酶，它们控制着TNFR1下游的两个连续的检查点，分别保护细胞免受RIPK1激酶活性依赖性凋亡（IKK检查点）和RIPK1激酶活性依赖性凋亡（NF-κB检查点）（图3）。控制上述两个细胞死亡检查点的激酶的激活高度依赖于与复合体I相关的泛素网络。因此，影响复合物I泛素化的条件，如抑制cIAP1、cIAP2和LUBAC，以及RIPK1泛素接受位点K377（小鼠RIPK1的K376）的突变或A20和OTULIN的缺陷，间接扰乱这些细胞死亡检查点并激活TNF的细胞毒性。值得注意的是，泛素对RIPK1死亡信号的抑制作用可以与它诱导NF-κB介导的基因转录的作用相分离。尽管上述两个细胞死亡检查点是为了抑制caspase 8的加工，但TNF感应仍激活了一个非致命的caspase 8池，并作为该途径的第三个检查点（"caspase 8检查点"），它通过裂解RIPK1，防止RIPK1激酶活性依赖的细胞凋亡和坏死（图3）。因此，根据细胞的情况，RIPK1的催化活性可以促进细胞凋亡、caspase 8介导的热凋亡或TNFR1下游的坏死。

图3. TNFR1的信号传导和TNFR1通路中三个特征的细胞死亡检查点的概述

迄今为止描述的所有三个细胞死亡检查点都被证明是防止小鼠TNF依赖性胚胎死亡或严重炎症病变的关键。此外，影响这些检查点的突变已被确定为人类自体炎症疾病的原因，进一步提供了这些细胞死亡检查点的临床意义。

3.在病原体防御中TNF诱导的细胞死亡

宿主与病原体的相互作用是作用于两种生物的主要选择压力。宿主必须适应病原体感染的生存，而病原体必须反过来发展机制以避免被宿主的免疫防御系统消灭。这种持续的压力选择了宿主的多种、分层和相互关联的防御机制。同样，病原体通过劫持炎症信号通路或阻断其他抗菌防御机制，发展出复杂的策略来规避宿主的免疫力。不同的TNFR1细胞死亡检查点似乎已经进化为宿主对这种微生物劫持的反应。事实上，TNF信号旨在建立一个炎症反应，主要是通过MAPK和NF-κB信号途径促进炎症基因的激活。激活这些信号通路的激酶也是破坏TNF细胞毒性的因素。因此，当病原体试图通过提供影响这些激酶正常激活的毒力或效应因子来抑制宿主的炎症基因激活时，细胞将转换其反应以诱导细胞死亡，从而激活另一种途径，通过释放损伤相关分子模式来提醒免疫系统。然而，TNF的细胞死亡并不总是对宿主有利的反应。至少在某些特定情况下，TNF介导的细胞死亡的过度激活确实是推动而不是防止微生物的致病性和致命性。

4.炎症性疾病中TNF诱导的细胞死亡

虽然TNF诱导的细胞死亡可以帮助在微生物感染期间作出适当的免疫反应，但当环境因素或基因突变导致的异常诱导时，它也可以变成各种（无菌）炎症性疾病的一个非常有害的过程。TNF不仅通过诱导炎症介质的表达，而且还通过触发细胞死亡来促进炎症性疾病的发病机制。例如，TNF在小鼠中诱发致命的败血症休克，该休克是由RIPK1激酶活性依赖的细胞死亡引起的，因为对RIPK1酶活性的遗传或药物抑制可以完全保护小鼠免受TNF诱发的细胞因子风暴、低温和发病的影响。caspase 8杂合体可部分挽救低体温症，而GSDMD缺失则可限制致死率。表明体内的炎症环境以某种方式影响RIPK1细胞死亡检查点。细胞毒性源于多种细胞因子的共同感应，而这些因子是由炎症环境提供的。TWEAK和CD40L在炎症性肠病（IBD）和类风湿性关节炎中上调，这是两种由TNF驱动的人类疾病，RIPK1抑制剂对其可能是有希望的。

TNF与TNFR2的结合也激活了非经典的NF-κB途径。因此，TNFR1和TNFR2对TNF的共同感应也有可能将TNFR1的反应从生存转向RIPK1激酶活性依赖的死亡。因此，有可能体外细胞毒性反应和体内对TNF的细胞毒性反应之间的部分差异源于TNFR2表达水平的不同，或者膜结合的TNF与可溶性TNF的表达不同，因为后者激活TNFR2的能力相对较差。除了TNF家族的配体外，最近还报道了TNF和γ干扰素的共同感应，通过激活JAK-STAT1-IRF1轴，诱导RIPK1激酶活性依赖的细胞死亡（细胞凋亡、热凋亡和坏死）。在SARS-CoV-2感染期间，TNF和γ干扰素的中和抗体组合被证明可以保护小鼠免于死亡，这一发现支持所报道的严重COVID-19期间高温炎症的致病作用。

直接或间接地使TNFR1途径内的一些细胞死亡检查点失活的突变也足以引起小鼠和人类的炎症性疾病（表1和2）。影响泛素信号正确调节的突变可以引发TNF介导的异常细胞死亡，并导致炎症性疾病。例如，cIAP1和cIAP2的缺失就属于这种情况，它导致了TNFR1信号传导引起的胚胎死亡。进一步的研究表明，成年小鼠中cIAP1和cIAP2的缺失会导致炎症和死亡，因为它释放了对caspase 8依赖性细胞死亡的刹车。泛素连接酶X-linked抑制凋亡蛋白（XIAP）的缺乏是X-linked淋巴增生综合征的原因，这是一种严重的炎症性疾病。通过使用基因靶向小鼠，XIAP被证明可以通过调节RIPK1的泛素化来防止TNF和RIPK3依赖的细胞死亡，这可能解释了X连锁淋巴增生综合征患者的高炎症。

LUBAC-和OTULIN-缺陷小鼠的表型支持了线性泛素链保护细胞死亡驱动的炎症这一概念。在所谓的Cpdm小鼠中，Sharpin的突变导致慢性增殖性皮炎，其特点是皮肤炎症病变、多器官炎症和免疫系统失调，这完全是由TNF介导的RIPK1激酶活性依赖的细胞死亡引起的。缺乏RIPK3或MLKL的Cpdm小鼠显示皮炎的发病时间延迟，多器官病变仅有部分改善，这表明坏死作用对该表型有贡献。然而，FADD的表皮缺失与RIPK3的缺失一起完全阻止了角质细胞的死亡和皮肤炎症，MyD88的遗传消融或通过抗生素耗尽微生物群可以挽救Cpdm小鼠的皮肤炎症，表明角质细胞的死亡会影响屏障的完整性，并通过感知已突破屏障的微生物的病原体相关分子模式而诱发皮肤炎症性疾病。对组织特异性LUBAC和OTULIN缺陷小鼠的研究进一步证实TNF和RIPK1激酶活性介导的细胞死亡是炎症病理的驱动因素。在人类中已经发现了HOIP、HOIL1和OTULIN的同型功能缺失的突变。这些突变是罕见的，引起新生儿潜在的致命的多器官自体炎症。大多数OTULIN相关的自体炎症综合征（ORAS；也称为耳聋）患者用TNF阻断剂成功治疗，确定TNF是自体炎症的主要驱动因素。RIPK1在抑制细胞死亡和随后的炎症方面有关键作用。小鼠IECs中RIPK1的缺失会诱发TNF介导的IEC凋亡引起的严重病变。虽然RIPK1通过作为NEMO招募的泛素化底物对NF-κB依赖性检查点做出了贡献，但体外研究表明RIPK1通过TNF途径中另一个有待发现的细胞死亡检查点发挥了更突出的抗凋亡作用。RIPK1缺乏的患者会出现炎症性疾病，包括IBD。

5.展望:细胞死亡阻断药物

实验研究已经证明了异常细胞死亡可能诱发炎症性疾病发展，但要确定促炎症细胞死亡对人类疾病发病机制的重要性，还需要使用特定抑制剂进行功能验证。RIPK1和RIPK3抑制剂以及GSDMD抑制剂目前正在调查中，作为人类炎症性疾病的潜在疗法。这类抑制剂可能成为自身免疫性疾病患者的替代治疗方法，特别是对那些对抗TNF治疗没有反应或出现不良反应的患者。RIPK1有一个独特的疏水口袋，可以异生调节其激酶活性，这使得开发对接该口袋的小分子激酶抑制剂成为可能。其中一些RIPK1靶向化合物已进入临床试验，用于治疗炎症性疾病，如溃疡性结肠炎、银屑病和类风湿性关节炎。另外，血脑屏障渗透型RIPK1抑制剂已经进入临床试验，用于治疗神经退行性疾病，包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症、阿尔茨海默病和多发性硬化症。TNF诱导的细胞死亡对RIPK1酶活性的要求在小鼠和人类之间也可能不同，这就提出了RIPK1激酶活性的确切功能这一重要问题，因为除了RIPK1之外，迄今为止还没有发现任何致命的底物。TNF可以触发caspase 8依赖性的GSDMD裂解。自从发现GSDMD是热病的中心媒介以来，GSDMD的抑制已被提议作为一种新的治疗策略，以防止不同疾病中的炎症病理。双硫仑（Antabuse）是美国食品和药物管理局（FDA）批准的用于治疗酒精成瘾的药物，被证明可以抑制人类和小鼠细胞中的焦化作用和炎症细胞因子的分泌，以及LPS诱导的败血症休克和多发性硬化症的小鼠模型。目前可用的三种GSDMD抑制剂（双硫仑、坏死磺酰胺和富马酸二甲酯）都是共价修饰反应性半胱氨酸，因此不是特异性的，需要发现GSDMD的特定小分子抑制剂。由于二次坏死-变态反应也可以通过caspase 3介导的GSDME的裂解和通过caspase 8介导的GSDMC的裂解来诱导，因此需要考虑其他GSDM抑制剂。最近的一项研究显示，质膜破裂是热凋亡和坏死细胞死亡的一个共同特征，但也发生在没有被及时吞噬和清除的凋亡细胞的二次坏死过程中，是由ninjurin 1积极调节和介导的。小鼠的临床前研究也表明，不同的细胞死亡信号通路不是孤立运作的，而是高度相互关联的，因此对一个模块的干预可能无法提供保护，而是可能涉及一个备用的细胞死亡通路。细胞死亡途径之间的这种密切串扰最终可能会影响到单一抑制性药物的使用，可能需要多种药物同时抑制多个细胞死亡模块或针对中央信号枢纽。

三、总结

这篇综述介绍了TNF诱导细胞死亡的分子机制，然后分别从多个不同的角度讨论了TNF诱导细胞死亡的过程，作者的观点涉及到TNF在病原体防御，炎症性疾病，以及细胞死亡阻断药物治疗中的重要角色，为我们的研究提供了最新的视角。

参考文献：van Loo G, Bertrand MJM. Death by TNF: a road to inflammation. Nat Rev Immunol. 2022 Nov 15:1–15. doi: 10.1038/s41577-022-00792-3.