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第七节菌种保藏和复壮 微生物保藏首先保持它不至于死亡绝种。同时尽量使菌种保持优良的性能。但是经过反复传代长期保存的菌种有的会出现衰退，这是一部分菌体在一定环境下产生变异，通过传代，变异者占了优势。若变异朝着不利于生产的方向发展，则表现为菌种退化。一般的表现为生长速度变慢,活性降低，导致代谢产物或菌体产量下降。这就必须进行复壮工作，使菌种恢复活力。 一、保藏方法保藏方法有如下几种: (一)斜面低温保藏法 将菌种接种到斜面固体培养基上，待菌体或孢子生长丰满后，放在约4℃的冰箱中保藏,每隔一定时间转接到新鲜培养基上。此法简单，霉菌可保藏半年，酵母3-4个月，细菌1-2个月。但经常需要移植，传代频繁，易于变种。 (二)液体石蜡封存法 菌体在斜面上长好后，倒入无菌并将水分蒸发掉的液体石蜡，石蜡液面高出斜面约1厘米(霉菌)-0.5厘米(细菌),试管直立于4℃冰箱内，可保存1年。使用时倒出石蜡液，从斜面上挑取少许菌体，移至新鲜培养基上，经培养即可应用。 (三)固体曲法 新鲜麸皮或大米、麦粒加水1∶0.8- 1.2(不同菌种对水分要求不同)，拌匀，装入小试管,塞好棉塞，用纸包好。用1公斤/立方厘米蒸气压，灭菌30分钟。冷却后，接入菌种，适温培养至孢子丰满,取出在真空下抽干，再经烧熔玻璃，拉长，把试管口封住。在低温下可保存1-3年。使用时用接种针挑取少量带菌的麸皮，移种到新鲜的斜面培养基上，培养后即可应用。 (四)砂土保藏法 将菌体或孢子混于灭菌的干燥砂土(80-100目过筛，用磁铁吸去铁屑)中，用量比例为2:1或3∶2，每管装入1-2克，真空干燥，放入有干燥剂(如无水氯化钙)的容器中封存，可保存1-2年。此法简便，是目前工业上常用的方法。 (五)冷冻干燥法，此法的原理是在很低的温度下，使微生物细胞快速冻结，保持完整。然后在真空下使水分挥发达到干燥。则使微生物处于休眠状态，不易发生变异而长久保存。并采用灭菌脱脂牛奶或灭菌血清作保护剂，装入安瓿管中,在零下30℃以下快速冷却结成固体,再经抽真空使水分挥发而干燥，最后将安瓿管熔封，放入冰箱内保藏,可达5-10年。对细菌、酵母的保藏效果良好，也可保藏霉菌，但对于出生孢子长的或不长孢子的霉菌效果不好。 二、菌种复壮菌种复壮的有效办法是进行纯种分离淘汰活性下降的变异菌株，把性能优良的单菌落分离出来，加以选择，扩大繁殖恢复原来的优良性能。未发现退化前，经常划线分离也是预防退化的有效措施。改变培养条件、营养成分、酸碱度或培养温度可使退化的菌种再复壮。此外，控制传代次数，例如砂土移植2-3代为宜，移植代数过多菌种易退化。有人把已退化的菌种接入灭过菌的肥沃土壤里培养，经一定时间后，又从中分离出菌体，发现其恢复原来的优良性状。 小结 微生物是从周围环境中吸取适当的营养物质来进行各种代谢活动。尽管各种微生物的营养要求不同，但各类微生物所需的基本营养物质--能源、碳源、氮源、无机盐类、生长因子和水分都是一致的。事实上，有机能源往往又是碳源或氮源。能源是指微生物进行各项生命活动时的能量来源;碳源是构成微生物细胞和代谢产物中碳架来源的物质;氮源是构成微生物细胞的细胞质中所含蛋白质、核酸、酶等的成分，以及代谢产物中氮元素来源的营养物质;无机盐是构成菌体必要成分;水分是细胞内外的溶媒，营养物质的吸收和代谢产物的排泄均通过水才能完成;生长因子是调节微生物代谢活动的微量有机物质。 培养基是人工配制适合微生物生长繁殖或积累代谢产物所需要的营养环境。培养基种类和配方很多:(1)按不同的来源划分为天然(麦芽汁)合成(察氏培养基)半合成(在合成培养基中加入某种天然成分)三种培养基;(2)按培养基物理状态划分为固体、液体和半固体三种培养基。种子培养基是保证工业上获得大量优质菌种的培养基，发酵培养基是使某种微生物积累大量代谢产物的培养基。 常用的培养基有:(1)霉菌培养基中的米曲霉培养基(包括斜面用和种子用的两种)、察氏培养基、麦芽汁培养基及米曲汁培养基等;(2)酵母培养基中的德国12号酵母培养基(包括斜面用、种子用和卡氏罐用的三种),酱醪2号酵母培养基，麦芽汁、马铃薯和饴糖等培养基等;(3)细菌培养基中的醋酸菌培养基(包括斜面用和种子用的两种)，沪酿1.01号醋酸菌培养基和细菌合成培养基等。 培养基灭菌的方法有火焰、干热、蒸气加压、间歇和巴氏灭菌法等五种。 斜面接种是将斜面培养基上的原菌在无菌条件下移接至另一新鲜的斜面培养基上。保持原菌的纯度与性能，是生产实践中的一个重要关键。纯种分离是对保管不良或接种不慎带有杂菌污染的菌种，作进一步增殖培养分离工作，取得新的纯菌种。最简单的分离方法是一种平板划线分离法。菌种保藏是为了保持不绝种，同时尽量保持优良的性质。保藏的方法有斜面低温保藏法、固体石蜡封存法、固体曲法、砂土保藏法和冷冻干燥法等。 |
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