【原】一个活性氧改变抗生素抗性基因的传递与调控案例

DOI：10.1016/j.biortech.2023.129539

过氧化钙改性秸秆-污泥堆肥系统中抗生素抗性基因的传递与调控研究

Transmission and regulation insights into antibiotic resistance genes in straw-sludge composting system amended with calcium peroxide

摘要

本研究通过在含有秸秆和污泥的堆肥系统中添加过氧化钙（CaO₂），开发了一种类似芬顿的系统。目的是研究抗生素抗性基因（ARGs）和细菌群落结构的影响。研究结果表明，加入 CaO₂ 有助于减少 ARGs。加入 CaO₂ 的试验组（T）的 ARGs 丰度比未加入 CaO₂ 的对照组（CK）低 19.02%，堆肥后两组的ARGs 丰度均低于初始丰度。此外，两组的细菌群落结构也发生了显著变化。冗余分析（RDA）显示，CaO₂ 诱导的芬顿样反应主要通过活性氧（ROS）影响温度、pH 值和细菌群落。总之，在堆肥过程中，添加 CaO₂ 可提高污水污泥中ARGs的去除率，改善堆肥质量。

研究背景

抗生素自发现以来，在预防和治疗细菌感染方面做出了重大贡献。它们是抵御细菌、真菌和其他病原体的重要武器。虽然抗生素可以迅速见效，但滥用抗生素会导致耐药性病原体的出现，最终使抗生素失效。与传统的化学污染物不同，抗性基因污染属于生物污染，它不仅能在不同的环境介质中持久存在，还能转移、传播，并表现出爆发的特征。这使得由耐药菌引起的传染病难以治疗。

污水处理厂被认为是抗生素抗性基因（ARGs）的滋生地。在整个污水处理过程中，污水污泥处理是一种重要的、被广泛采用的处理方法。污水污泥是环境抗性基因研究的重点。污水处理厂每天接收和处理数千吨污水，包括人类生活污水、医疗废水、工业废水、水产养殖废水、人类和动物的排泄物以及制药厂和医院的污水，都蕴藏着大量的抗药性细菌和基因。这些污染物积聚在污水处理厂，尤其是污水污泥中，从而将其转化为巨大的抗药性基因库。然而，目前的污水处理工艺无法完全清除污水环境中的细菌和抗生素耐药性基因。农作物秸秆是农业的主要副产品。在中国，大量秸秆仍未得到充分利用。如果管理不当，秸秆将对人类和环境造成严重威胁。堆肥是减少或消除来自农作物秸秆和污水污泥的病原体和有机污染物的低成本方法。

(CaO2）被称为"固体"过氧化氢（H2O2）。CaO2颗粒可在潮湿环境中缓慢释放H2O2，有效减少H2O2的歧化反应。最新研究结果表明，CaO2 具有增强堆肥中微生物新陈代谢的能力。堆肥过程中产生的活性氧（ROS）能有效影响微生物的活性，促进ARGs的去除。CaO2可通过 CaO2-Fenton-like系统促进ROS的产生，表明其具有促进去除ARGs的潜力。然而，CaO2-Fenton-like 系统在污泥堆肥中的适用性和有效性仍不确定。CaO2-Fenton-like系统对堆肥中ARGs的扩散和调控机制的具体影响仍不确定。

在本研究中，引入CaO2建立了一个类似Fenton的系统，以分析秸秆和污水污泥堆肥过程中对ARGs和微生物群落的影响。本研究的主要目标如下：(1)考察Fenton-like系统对污泥堆肥过程中ROS（OH、H2O2和 O2-）的影响；(2)研究CaO2对堆肥理化参数的影响；(3)研究 Fenton-like 系统中ARGs丰度的变化；(4)研究微生物群落的变化；(5)利用冗余分析（RDA）阐明温度、pH值、有机物（OM）、水分（Moi）和微生物群落之间的联系。

实验设计

秸秆和污水污泥是本研究的堆肥材料。秸秆来自广西大学农学院农场，污水污泥来自广西南宁北投中联净水厂。此外，研究中使用的CaO2添加剂由中国绍兴上虞洁华化工有限公司提供。堆肥过程持续了 55 天，在此期间，污水污泥和秸秆以 3:1 的比例（基于湿重）充分混合，平均分成两组。试验组（T）添加96克（堆肥干重的 1%）75% 的 CaO2，对照组（CK）不做其他处理。然后，将两堆大小相等的肥料分两批放入 60 升的隔热堆肥反应器中，使其具有透气性。为了满足微生物对氧气的需求，在第0、5、9、17、28、40 和 55 天揭开肥堆，使其自然通气。采用多点均匀取样法收集约 300 克样品，同时旋转反应器并将其保持在零下 20 ℃。随后，一部分重达100克的样品被指定用于元基因组分析，而剩余的样品则被指定用于后续实验。

过氧化钙条件下活性氧的动态变化

CaO2 对堆肥的调节主要涉及建立一个类似 CaO2-Fenton 的系统。

在堆肥过程中，H2O2 可由多种胞外酶生成，其中大部分属于氧化还原酶超家族。微生物在生长繁殖过程中还能产生 Fe2+，形成腐殖质。因此，在堆肥过程中，微生物可通过胞外酶产生 H2O2，并通过公式（2）、（4）分别产生 O2- 和·OH。

如等式（1）、（2）所示，添加 CaO2 导致堆肥过程中O2-的产生量增加。然而，CK堆主要是由式（2）产生O2-。O2-的含量经测量后如图1a所示。CK和T的O2-含量都呈现出先增加后减少的趋势，在第17天分别达到0.253和0.647的峰值。在堆肥过程中，CK堆中的 O2-含量略有变化，这可能是由于某些微生物产生的 O2 吸收了电子所致。在整个堆肥过程中，与CK堆相比，T堆的O2-含量一直明显较高。这一观察结果可归因于添加CaO2的有利影响，因为CaO2可促进堆肥反应。此外，CaO2的溶解速率在调节系统内的 O2- 含量方面起着至关重要的作用。

·OH含量（图 1b）和 H2O2 含量（图 1c）的变化趋势与 O2-相似，都是先上升后下降。第17天，CK中·OH 和 H2O2 含量的峰值分别为 0.454 和 67.678 mmol/kg，而T中分别为 0.713 和 79.989 mmol/kg。与CK相比，T中·OH 和 H2O2 含量较高，这可能是由于在堆肥过程中，CaO2 与 H2O 在弱酸性条件下发生反应（式(3)），然后发生类似芬顿的反应生成 ·OH（式 (4)）。然而，CK主要通过胞外酶、微生物和式 (4) 产生 H2O2 和·OH。

图 1.堆肥过程中活性氧（ROS）（a）O2-、（b）·OH和（c）H2O2 的变化。

理化特性的变化

堆肥涉及重要的物理化学特性，包括温度、OM、pH值和Moi。在堆肥过程中，温度对微生物的嗜性和有效降解OM起着至关重要的作用。整个过程分为四个阶段（图2a）：加热阶段（0-5 天）、嗜热阶段（5-17 天）、冷却阶段（17-40 天）和成熟阶段（40-55 天）。CK组和T组堆肥过程的温度在11天以上都保持在50℃以上，值得注意的是，在第5-17天期间，T组的温度高于CK组，这表明添加CaO2提高了微生物的嗜性并加速了堆肥过程。随着整个过程中养分的消耗，T组的温度最终会接近CK组的温度。如图2b所示，可以观察到在整个过程中，T组的pH值始终高于CK组。两组的pH值都出现了先上升后下降的现象，这可能是由于 CaO2 参与了产生碱性环境的反应。此外，随着微生物将含氮物质分解成NH4+，pH 值会进一步升高。在堆肥过程中，特别是在冷却阶段，由于硝化过程中H+的积累，pH值会逐渐降低。值得注意的是，在冷却阶段，T组的pH值下降幅度超过了CK，这可能是由于SOS响应机制的启动。

通过降解OM形成更稳定的HS是评估堆肥质量的重要标准。如图2c所示，CK中的OM从66.39%降至53.86%，T组中的OM 从66.40%降至52.46%。与冷却阶段相比，嗜热阶段的OM降解率明显更高。这是由于微生物在嗜热期（第5-17天）迅速增殖，消耗OM以满足新陈代谢的需要。在堆肥的后期阶段，随着可降解OM的消耗以及温度的降低导致微生物活性下降，OM的降解率也随之降低。与CK相比，T组的最终OM含量较低，这表明在污泥堆肥中添加CaO2可提高堆肥质量。

在研究期间，两组的Moi含量均呈现持续下降趋势（图2d），这可能是由于微生物生长、新陈代谢和营养降解需要水分。此外，一个值得注意的现象是，与CK相比，T组中Moi的减少率要高得多。这可归因于氧化反应的刺激以及微生物生长和新陈代谢的增强。通过引入 CaO2、O2-、·OH和 H2O2 等 ROS 的生成促进了堆肥过程。

图 2.堆肥过程中 (a) 温度、(b) pH 值、(c) 有机物 (OM) 和 (d) 水分的变化

抗生素抗性基因的丰度变化

图3a显示了整个过程中ARGs丰度前15位的变化情况。结果表明，在污泥堆肥过程中，添加CaO2有利于去除相对丰度前15位的ARGs。大多数ARGs在名称水平上的丰度随着堆肥过程而显著下降。例如，evgS、bcrA、parY、tetA(58)、macB、efrA和baeS 等基因的丰度在第5-17天均显著下降，T组中所有ARGs的丰度在成熟期均低于CK组。这可能是由于携带ARGs的某些宿主细菌无法在整个过程中产生的高温下存活，而ROS的增加也抑制了ARGs的表达，从而导致这些ARGs的丰度降低。添加CaO2可提高堆肥过程中的温度，促进O2-、·OH和H2O2等ROS的生成。这些ROS可与细菌细胞膜、核酸、蛋白质和其他生物大分子相互作用，导致其损坏或氧化。因此，ARB 会被抑制或杀死。此外，ROS还能诱导ARGs突变或降解，导致堆肥过程中ARGs的数量减少。因此，ARGs 的传播和增殖也会减少。在嗜热时期，某些ARGs（如oleC、TaeA、patA、novA等）在名称水平上的丰度有所增加。这可能是因为携带这些ARGs的宿主细菌属于嗜热菌，它们在高温下表现出活跃的生长和新陈代谢，导致这些ARGs进一步扩增。在堆肥成熟阶段，这些ARGs的丰度最终会低于初始丰度。这可能是由于在整个过程中温度降低，微生物所需的营养物质消耗，从而大大降低了微生物的活性，最终导致ARGs丰度下降。此外，ROS对ARGs的氧化会导致其功能丧失，从而达到抑制和清除的效果。

如图3b所示，结果表明在污泥堆肥过程中，macrocyclodiene-lincomide streptomycin (MLS), Multidrug, Tetracycline, Aminocoumarin, Peptide, Glycopeptide, Beta-lactam, Pleuromutilin and Fluoroquinolone在众多ARGs中占主导地位。总体而言，好氧堆肥使ARGs的发生率和种类明显减少。然而两组中Beta-lactam和Glycopeptide的含量不降反升。具体来说，在CK组中，Beta-lactam的含量从3.37%增加到6.00%，Glycopeptide的含量从5.25%增加到6.28%。在T组中，Beta-lactam的含量从3.37%增加到8.28%，Glycopeptide的含量从5.25%增加到8.51%。先前的研究报告指出，堆肥过程中Beta-lactam和Glycopeptide物质丰度的增加可能是由于抗生素耐药菌的大量繁殖，寄生了对这些抗生素产生耐药性的基因，从而导致其相对丰度的增加。T中Beta-lactam和Glycopeptide的丰度明显高于CK，这表明添加CaO2促进了其宿主细菌的生长和代谢活动。在堆肥发酵过程中，Aminocoumarin、Multidrug、Peptide和Pleuromutilin基因的丰度逐渐降低。研究结果表明，从第1天到第55天，Aminocoumarin基因在CK中减少了0.42%，在T中减少了1.8%；Multidrug基因在CK中减少了5.4%，在T中减少了6.28%；Peptide基因在CK中减少了 0.09%，在T中减少了2.53%；Pleuromutilin基因在CK中减少了0.2%，在T中减少了0.91%。值得注意的是，T的下降幅度比CK更大。结果表明，添加CaO2 能促进大部分ARGs的消除。

图 3.堆肥过程中 ARGs 的演变 (a) 在名称层面前 15 个基因的相对丰度；(b) 在抗生素类别层面前 15 个基因的相对丰度。

宿主细菌抗生素耐药基因的变异

图4a显示了ARGs在门水平的宿主细菌丰度。分析表明，污泥堆肥样本主要由六个门组成：Actinobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Firmicutes、Bacteroidetes和Nitrospirae占总数的90%以上。在整个过程中，微生物群落结构发生了重大变化。值得注意的是，随着堆肥过程的进行，Actinobacteria和Proteobacteria成为主要的门类。在堆肥成熟阶段，T（52.36%）中Actinobacteria的数量明显高于 CK（42.13%）。堆肥中通常会滋生Chloroflexi和Firmicutes，它们是能够在兼性厌氧和强制性厌氧条件下生长的普遍微生物。适当的有氧条件可以促进Chloroflexi和Firmicutes的增殖，但过度的有氧条件会阻碍它们的生长和代谢活动。此外，在加热阶段，当ROS水平处于适当范围内时，它们的丰度往往会上升。在嗜热阶段，当ROS含量过高时，Chloroflexi和Firmicutes的丰度会逐渐降低。随着 ROS 的消耗和 SOS 响应机制的影响，它们的丰度在堆肥成熟阶段有所增加。此外，在整个污泥堆肥过程中，加入 CaO2 会导致Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria的总丰度全面提高。这些门类丰度的增加可能会促进堆肥成熟，并有助于去除ARGs。

图 4b 显示了与ARGs基因水平相关的微生物物种丰富度的显著变化。CK和T中的优势微生物为Saccharomonospora（16.13%，9.25%）、Streptomyces（13.12%，16.68%）、Nonomuraea（3.71%，7.86%）、Thermostaphylospora（9.40%，0.85%）、Actinotalea（4.31%，4.37%）、unclassified_p__Proteobacteria（1.77%，1.63%）、 Bacillus（2.50%，0.87%）、Chelatococcus (4.98%,4.22%)、Thermocrispum (3.54%,5.93%)和Microbacterium (0.51%, 1.3%)。

图4c显示，第 55 天，CK中的OTU数量为15,417 个，T 中的OTU数量为 16,444个，明显高于第0天的OTU数量（2293 个）。此外，在第55天，CK和T中同时存在 13,721个OTU，而T中单独存在的 OTU 数量为2723个，大大超过了CK（1696个）。这些发现表明，添加 CaO2 不仅能促进 ARGs 的清除，还能使微生物群落更加多样化。值得注意的是，并非所有基因都被不加区分地移除。

图 4.堆肥过程中前 15 个抗生素耐药基因对应的宿主菌相对丰度变化：（a）微生物群落在（a）门和（b）属水平上的相对丰度；（c）两堆 OTU 的维恩图。

微生物对抗药性机制的物种贡献

图5通过元基因组学分析，说明了微生物在基因水平上对抗性机制的贡献。值得注意的是，在堆肥过程中，CK和T在基因水平上对抗性机制的贡献有明显的区别。在堆肥成熟阶段，T 对抗生素耐药性机制的贡献率（抗生素外流 56.79%，抗生素靶向改变 49.64%）高于 CK（抗生素外流 47.63%，抗生素靶向 31.98%），这进一步揭示了 CaO2 的添加促进了 ARGs 的去除。此外，根据上述分析，上述细菌的丰度与 ROS 的水平直接或间接相关。正是 CaO2 的添加导致了 ROS的变化。因此，这一现象进一步证实了 CaO2 的添加可促进 ARGs 的去除和堆肥的成熟。

图 5.通过元基因组学分析在基因水平上微生物对堆肥过程中抗性机制（a）CK 和（b）T 的物种贡献。

冗余分析

为了深入探讨 ROS（包括 O2-、·OH 和 H2O2）水平与 ARGs 清除之间的相关性，我们进行了 RDA 分析，以探讨相对丰度最高的前六个门类（图 6a）与丰度最高的十个 ARGs（图 6b）之间的相互关系。

根据图 6a 中显示的结果，Actinobacteria、acteroidetes、Firmicutes 和Chloroflexi与 H2O2 和·OH呈正相关，而变形菌与 O2-、·OH和 H2O2 呈负相关。这表明，H2O2 和·OH有利于增加Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi的丰度，但不利于增加Proteobacteria的丰度。如图6b所示，丰度排名前10位的ARGs几乎都与 H2O2 和·OH呈负相关。此外，图6a和6b都表明温度和pH与ROS呈正相关，而 Moi 和 OM 与 ROS 呈负相关。图 6a 和图 6b 的这些结果表明，在整个污泥堆肥过程中，ROS 对促进 OM 降解和微生物代谢起着至关重要的作用。pH 值和温度与 ROS 呈正相关，而 OM 值和 Moi 值与 ROS 呈负相关，进一步证实了这一论断。这些发现强调，在整个污泥堆肥过程中，ROS 的增加是消除 ARGs 和优化微生物的关键因素。

图6. 理化性质与活性氧和（a）核心细菌群落；（b）核心抗生素抗性基因（ARGs）之间相关性的冗余分析

结论

该研究表明，在污泥堆肥中加入 CaO2 可促进整个过程和微生物的生长。研究还揭示了堆肥系统对 ROS、ARGs 和细菌群落的影响。该系统主要影响温度、pH 值和 ROS 水平，从而抑制和消除 ARGs。堆肥后，CK 组和 T 组中各种 ARGs（如 bcrA、parY、tetA、macB 等）的丰度均显著下降，其中 T 组的丰度低于 CK 组。总之，所提出的方法为解决污水厂中 ARGs 过多的问题和提高堆肥质量提供了一种可行的解决方案。

根际互作生物学研究室 简介