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大家好，本期小编分享今天讲的这篇2022年12月，美国麻省理工大学的科研人员在《Nature Genetics》发表文章“The lands cape of tumor cell states and spatial organ ization in H3-K27M mutant diff use mid line glioma across age and loca tion”，利用单细胞空间多组学方法分析了包含各种年龄和不同部位的H3-K27M 驱动的弥漫性中线胶质瘤患者的肿瘤，描述了H3-K27M DMG胶质瘤细胞状态和空间景观。文章为肿瘤模型及用药策略的建立提供了有价值的参考的研究论文。 01 研究背景 我们的研究表明，OPC样和更分化的神经胶质样细胞在所有临床解剖学组中普遍存在。同时，神经元样肿瘤细胞不存在，这与年龄和位置无关，与其他胶质瘤类型形成鲜明对比。 因此，这可能是K27M突变普遍将肿瘤细胞向OPC样倾斜并远离神经元样状态的直接后果，与时空影响脱钩。组蛋白 3 赖氨酸 27 至蛋氨酸 （H3-K27M） 突变最常见于儿童脑桥的弥漫性中线胶质瘤 （DMG），但在成人中也越来越被认可。 它们在不同年龄和中线位置的潜在异质性研究严重不足。在这里，通过剖析患者H3-K27M DMG的综合队列的单细胞转录组，表观基因组和空间结构，我们描绘了年龄和解剖位置如何根据共享驱动突变塑造胶质瘤细胞内在和外在特征。 我们表明，存在于所有临床解剖学组中的干细胞样少突胶质前体样细胞根据位置显示出不同的成熟水平。我们揭示了间充质癌细胞状态与年龄之间以前被低估的关系，这与免疫微环境中的年龄依赖性差异有关。 此外，我们解析了H3-K27M DMG细胞群的空间组织，并鉴定了有丝分裂的少突胶质细胞谱系生态位。总的来说，我们的研究为理性建模和治疗干预提供了一个强有力的框架。 见图一 通过单细胞多组学分析的H3-K27M DMG队列。  图一 a，工作流程示意图。 b，临床分子队列特征。上方的图例条描述了通过scRNA-seq（n = 18）/snRNA-seq（n = 25）、snATAC-seq（n = 8）和/或单细胞原位测序（n = 14）进行的单细胞分析方法。下行指定了遗传表征的方法。最常检测到和先前报道的共突变显示在通过全外显子组或靶向外显子组测序分析的 43 个肿瘤中的 50 个的中间。临床解剖学特征由底部图例条显示。 c，由scRNA-seq/snRNA-seq分析的所有细胞的UMAP。颜色图例突出显示了恶性、基于聚类检测的非恶性细胞类型、拷贝数谱和典型标记基因的表达。对于此可视化，scRNA-seq/snRNA-seq数据通过Harmony算法进行整合，同时对scRNA-seq和snRNA-seq数据分别进行下游分析，以控制技术偏差。 d，从scRNA-seq/snRNA-seq数据推断的拷贝数改变（CNA）谱。细胞按其原始肿瘤作为行排序，并按其跨染色体位置（列）的CNA模式聚集。缺乏CNA的代表性新鲜刺入非恶性细胞如上图所示。 见图二 H3-K27M DMG的肿瘤内转录异质性。  图二 a，所有新鲜肿瘤细胞的UMAP中，突出显示已识别的簇。 b，已鉴定新鲜肿瘤细胞簇的标记基因（y轴），在x轴上分组和注释。点大小表示给定簇中表达基因的细胞的百分比，色标显示缩放的平均相对表达。 c，热图表示NMF在所有新鲜肿瘤细胞（列）中鉴定的肿瘤元程序的前30个标记基因（行）的相对表达（颜色条）。 d，每个新鲜样本（x轴）肿瘤细胞中新鲜肿瘤衍生的NMF元程序（颜色图例）的比例（y轴）。 e，由SCENIC派生的细胞类型特异性TF调节网络（调节子，x轴），根据其标准化特异性评分（y轴）绘制图。 f，箱线图表示成人（n = 10）与儿童（n = 23）年龄组所有新鲜和冷冻肿瘤中元程序的相对频率。中位数由箱线图内的粗线标记，第一和第三个四分位数由上限和下限标记，1.5 倍四分位数间距由胡须标记。三个星号表示由贝叶斯scCODA模型评估的可信统计变化，FDR<0.05，没有多次测试校正。 g，箱线图表示按脑桥 （n = 19） 与丘脑 （n = 14） 位置分组的所有新鲜和冷冻肿瘤中元程序的相对频率。中位数由箱线图内的粗线标记，第一和第三个四分位数由上限和下限标记，1.5 倍四分位数间距由胡须标记。三个星号表示由贝叶斯scCODA模型评估的可信统计变化，FDR<0.05，没有多次测试校正。 h，在两个成人和两个儿科 H44-K14M DMG 中对 MES 样 （CD3） 和巨噬细胞 （CD27） 标记进行原位杂交。每个样品染色10-15张载玻片，每张载玻片拍摄3-27个视野。 i，成人和儿童 H<>-K<>M DMG 的 OC 样与 AC 样（x 轴）和 OPC 样（y 轴）评分的二维表示。 见图三 OPC样细胞的区域特异性状态。  图三 a，热图表示所有新鲜肿瘤细胞（列）中不同OPC元程序的前30个标记基因（行）的相对表达（色标）。 b，小提琴图描绘了OPC样-1，OPC样-2和OPC样-3亚群中典型OPC标记基因的对数标准化绝对表达。显示AC样单元格（橙色）中的表达以进行比较。 c，热图表示肿瘤OPC样-3，OPC样-2和OPC样-1群体（列）中规范前OPC和OPC标记基因（行）的相对表达（色标）。 d，从人类海马的scRNA-seq数据集将OPC样-1，OPC样-2和OPC样-3群体（x轴）投影到正常的前OPC和OPC（y轴）上46.色标表示肿瘤细胞中正常细胞特征的表达分数，而点大小表示正常细胞中肿瘤细胞特征的表达分数。 e，从人类发育皮层的scRNA-seq数据集将OPC样-1，OPC样-2和OPC样-3群体（x轴）投影到正常的前OPC，OPC和OAPC（HOPXSPARCL1神经胶质祖细胞）（y轴）上++41.色标表示肿瘤细胞中正常细胞特征的表达分数，而点大小表示正常细胞中肿瘤细胞特征的表达分数。 f，从新生小鼠皮层的scRNA-seq数据集将OPC样-1，OPC样-2和OPC样-3群体（x轴）投射到不同成熟阶段（y轴）的不同正常OPC上43.色标表示肿瘤细胞中正常细胞特征的表达分数，而点大小表示正常细胞中肿瘤细胞特征的表达分数。 g，TF调节网络（调节，x轴）由SCENIC 针对每个肿瘤OPC样亚群得出，与其标准化特异性评分（y轴）作图。h，点图表示不同OPC样肿瘤状态的比例分布（平均值±2 × s.e.m），按脑桥（n = 11）和丘脑（n = 6）位置分组的所有新鲜肿瘤。三个星号表示贝叶斯scCODA模型评估的可信统计变化，FDR<0.05，没有多次测试校正。 见图四 H3-K27M DMG细胞群的特征染色质谱。  图四 a，UMAP将所有snATAC-seq衍生的肿瘤细胞核批量效应校正后，突出显示从头分配的簇。 b，在snATAC-seq衍生细胞状态中具有差异基因活性（色标）和可访问细胞核比例（点大小）的顶部标记基因的点图表示。 c，热图显示13，632个基本连接的CRE基因对（左行，染色质可及性;右行，链接基因表达）的标准化染色质可及性和基因表达。使用分层聚类对行进行聚类。对于可视化，随机选择了 5，000 行。 d，条形图表示每个基因链接CRE数量的分布。红色虚线表示定义 GPC 的链接 CRE 数量的前 5% 阈值。 e，按链接的CRE数量（y轴）对基因（x轴）进行排名，突出显示具有前20个链接CRE的基因。在肿瘤细胞状态中差异表达或由SCENIC 鉴定为细胞状态特异性TF调节子的基因根据图例进行着色。 f，维恩图表示GPC与H3-K27M DMG超级增强子相关基因的重叠，由Nagaraja等人鉴定。19.图中显示了双侧超几何检验的 P 值。 g，综合 TF 分析的点图，表示顶部单元格状态（列）特定的 TF（行）。通过scRNA-seq评估的平均相对表达水平由点大小表示，通过SCENIC 分析推断的相对活性由色标表示。 h，i，h，OPC样细胞特异性SEZ6L基因和i，AC样细胞特异性ITPKB基因基因位点的综合表示。在顶部，假体染色质可及性轨迹图按细胞类型着色。在中间一排，条形图描绘了推定CRE的位点。在底行中，环表示每个峰的染色质可及性与其链接基因表达之间的相关性，分别代表富集于OPC样细胞特异性SOX8（h），AC样细胞特异性SOX9（i），TF基序的假定CRE。 见图五 H3-K27M DMG的骨髓细胞景观。  图五 a，通过scRNA-seq分析的TAM的UMAPs，通过小胶质细胞和巨噬细胞基因集的表达评分进行颜色缩放。 b，TAM的UMAP按分类分类为巨噬细胞或小胶质细胞类型。 c，小提琴图描绘了TAM中代表性小胶质细胞和巨噬细胞标记基因的对数标准化表达水平，评分为小胶质细胞或巨噬细胞。 d，点图表示成人和儿童肿瘤中指定巨噬细胞与小胶质细胞比例的分布（平均值± 2 × s.e.m）（N = 16 个生物学独立样本）。三个星号表示由贝叶斯scCODA模型确定的可信统计变化，FDR<0.05，没有多次测试校正。 e，成人和儿童TAM中OSM基因对数标准化表达水平的小提琴图。三个星号表示P = 0.003（双侧柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验）。浅绿色的三个星号代表成人和儿童巨噬细胞肿瘤之间的比较。 f，成人和儿童肿瘤细胞中OSMR基因对数标准化表达水平的小提琴图。三个星号表示P = 0（双侧柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验）。 g，成人和儿童TAM中MES样标记基因的对数标准化表达水平的小提琴图。显示了来自不同比较的P值（双侧Kolmogorov-Smirnov试验;黑色：巨噬细胞和小胶质细胞之间的年龄组比较;浅绿色：成人与儿童巨噬细胞;深绿色：成人与儿童小胶质细胞）。 h，不同年龄组（E14.5，P7，P60）的正常小鼠小胶质细胞和脑骨髓细胞的单细胞图谱中MES样状态相关配体和标记基因（行）的缩放相对表达（色标）的热图表示52（列）。 见图六 H3-K27M DMG的单细胞空间转录组结构。  图六 a，HybISS实验方法示意图。简而言之，mRNA通过RT原位扩增，产物cDNA与定制的互补挂锁探针杂交。接下来，运行RCA反应以产生一团DNA，然后可以用个体化的基因桥探针进行条形码编码并发出荧光条形码。成像后，剥离样品上的桥探针，并用不同的荧光团重复循环五次，以根据其解码序列解码和鉴定基因信号。 b，一个原代人H3-K27M DMG切片中恶性和非恶性细胞类型/状态分配的代表性图像（UMPED65_A2;整个肿瘤切片的1个实验，分配N = 22，813个细胞），概述了样品中恶性和非恶性细胞群的分布。 c，通过 pciSeq 在 16 个人类 H3-K27M DMG 样本（y 轴）中鉴定的 scRNA-seq 衍生肿瘤细胞状态（颜色图例）的比例（x 轴）。 d，小提琴图表示成人MES样细胞比例的分布与通过空间转录组学分析的儿科H3-K27M DMG（N = 7，004个MES样细胞在16个生物学独立样本中）的分布。晶须显示最小/最大比例。星号表示 P = 0.024（双侧 t 检验）。 e，恶性细胞群之间邻域富集分析的热图表示，在所有样品中以 50 μm 处鉴定。色标表示当前将第二种细胞类型除以找到第二种细胞类型的概率时找到细胞的概率。 f，来自四个主要人类H3-K27M DMG中的三个的代表性多重IF CODEX图像，显示了恶性（标记物：H3-K27M），OPC样（标记物：PDGFRA），OC样（标记物：BCAS1），AC样（标记物：GFAP）和增殖细胞（标记物：Ki67）的空间不同亚群。对于每个肿瘤，进行一次实验，在整个肿瘤切片上每个样品分析~70，000至1万个单个细胞。 g，样本范围散点图，表示每个细胞群与其他细胞群聚类（中心性程度，y 轴）或与自身聚类（聚类系数，x 轴）的趋势。 见图七 H3-K27M DMG的时空上下文特定组成的示意图摘要。  图七 比较了儿童与成人患者组（x轴）和脑桥与丘脑中线位置（y轴），并分别描绘了肿瘤细胞组成的代表性模型图像。所有肿瘤群在OPC样细胞中都很丰富，并且还含有更多分化的AC样，OC样，MES样和非恶性微环境细胞，但缺乏NPC/神经元谱系的肿瘤细胞，如单细胞多组学（颜色图例）所描述的那样。 MES样细胞随年龄增长而增加，如绿色箭头所示，与肿瘤免疫微环境中的年龄相关变化有关;特别是，小儿肿瘤中小胶质细胞的比例较高，而成人肿瘤中巨噬细胞的比例增加。 OPC样细胞的不同成熟阶段存在位置特异性 - 脑桥肿瘤含有不太成熟的前OPC样细胞，而丘脑肿瘤富集为更成熟的谱系承诺OPC样细胞，要么是由于区域特异性细胞内在特征的结果，要么是由于通过局部环境生态位内的相互作用驱动的与位置相关的多样化。 02 研究结论 我们的研究表明，OPC样和更分化的神经胶质样细胞在所有临床解剖学组中普遍存在。同时，神经元样肿瘤细胞不存在，这与年龄和位置无关，与其他胶质瘤类型形成鲜明对比。因此，这可能是K27M突变普遍将肿瘤细胞向OPC样倾斜并远离神经元样状态的直接后果，与时空影响脱钩。 |
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