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细胞冻存 细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。
细胞冻存流程示意图 目前，细胞冻存主要的技术为液氮冷冻法，实际冻存过程中，需要进行梯度温度冻存，并加入适量的保护剂以保证细胞内外的水分不会形成冰晶造成细胞的损伤或死亡。 什么时候可以冻存细胞 在准备冷冻靶细胞之前，必须确保细胞处于最佳生长状态，这可以通过以下指标进行观察： 1 培养基的颜色和浑浊情况 培养基的颜色可以指示细胞是否过度生长（例如，如果细胞是黄色，则表示它们过度生长）；介质的浑浊度通常表明存在污染，不适合冷冻。 2 细胞培养的时间 通常，建议将新恢复的细胞冷冻约两周。如果细胞连续培养两个月以上，性状率会发生一些变化，此时的细胞不适合冷冻。 3 细胞的数目 在冻存过程中，每只冻存管内细胞最佳浓度为5x10^6个/ml—1x10^7个/ml，高密度或低密度对细胞存活率有一定影响。当细胞数量不足时，不建议冷冻细胞。
细胞冻存前需要做什么预处理吗 01 在细胞被消化和离心后，去除上清液并收集细胞沉淀，它们通常需要用冷冻保存液再次悬浮并转移到冷冻保存管中。冻存液中一般含有渗透型的保护液如甘油或10%的二甲基亚砜（DMSO）和10%-90%胎牛血清。 02 细胞内外的主要成分是水。如果细胞在没有保护溶液的情况下直接冷冻，细胞内外的水会凝结成冰晶，对细胞造成内源性的机械损伤。细胞内的水凝结引起的细胞脱水也会引起细胞内pH值的变化、蛋白质变性、细胞内部器官功能的丧失，甚至细胞核内的DNA损伤，最终可能导致细胞死亡。 03 而冻存液往往都是易溶解的小分子物质，具有细胞渗透性，可以穿过细胞膜，进入细胞内，降低冰点，同时又可以提高细胞膜对水的通透性，使得细胞内水分渗出到细胞外，从而减少细胞内冰晶的形成。
*一些特殊的细胞，如原代皮肤细胞，会额外添加表面保护剂，如海藻糖，以提高细胞存活率。 *由于DMSO对大部分细胞无毒性作用，因此广泛用于细胞冷冻保存；还有一些细胞，一些细胞对二甲基亚砜的毒性敏感，甘油可以用作冷冻保护剂。 冷冻保存液的另一个主要成分是胎牛血清。由于冷冻保存中的细胞代谢仍然很弱，向冷冻保存液中添加血清可以为细胞提供营养。同时，富含血清的蛋白质和其他大分子物质可以更好地保护细胞。实验证明，低温保存液中高比例的血清有利于提高细胞活力。因此，90%的血清加10%的保护液可用于冷冻期间的细胞保存。对于常见的易于培养的细胞系，10%-20%的血清加上一定量的完整培养基和DMSO也能很好地保存细胞。
细胞冻存的降温过程是怎样的 细胞冷冻保存过程是一个梯度冷却过程，液氮是细胞最终保存的最佳冷冻介质。液氮的温度可以低至-196℃。在这种低温条件下，细胞保存理论上是永久的。 1 人工传统降温法 冻存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小时（或过夜，最长放置时间不要超过一个月）→ 转移至液氮长期储存。 *细胞置于4℃及-20℃的时间不可太长，且从4℃转移至-20℃时，最好颠倒混匀下细胞，防止细胞大量沉降堆积至管底，影响细胞复苏。 2 借助冻存盒、细胞渐冻仪等工具 利用介质特性或制冷程序进行独立梯度冷却： 将冷冻管放入细胞冷冻箱内（冷冻箱内需提前预冷至4℃，并检查箱内异丙醇或其他液体是否充足），然后将其置于-80℃冰箱中16-18小时（或过夜，最长储存时间不应超过一个月）→ 将其转移到液氮中长期储存。 将低温保存管放入低温镜中，以1-2℃/min的冷却速度下降至-100℃→ 将其转移到液氮中长期储存 使用液氮罐的安全小提示 液氮（Liquid nitrogen）是液化的氮气，是生命科学研究和医药行业常用的冷冻储存介质，具有以下理化性质： 01 超低温性：液氮的沸点为－195．8，液氮气化时每公斤可吸热 48 大卡； 02 无色、无臭、无毒的液体； 03 窒息性：氮气本身不能致使人窒息，但在一定空间内，如果氮气过多而隔绝氧气，操作者也会引起窒息。 因而，在操作液氮罐时，需要注意以下安全使用规范： 01 防止冻伤。虽然它渗透性很弱，但当人体皮肤接触液氮时会受到严重冻伤。在放置细胞时，一定要确保穿戴了厚手套、护目镜、实验服； 02 操作轻柔，防止液氮溅出； 03 尽可能地快速操作。由于液氮在空气中会迅速吸热气化，为了避免样品温度变化影响其质量，需尽快操作； 04 做好维护。定时查看液氮余量，确保罐内液体高度没过重要样品，最少时，液氮不可少于罐体容积的三分之一。  苏州赛普生物科技有限公司成立于 2018 年，是一家专门从事高端生物医疗耗材研发、生产和销售的苏州工业园区重大领军人才企业、江苏省科技型中小企业、国家高新技术企业，致力于为全球客户提供分子诊断、药物研发、细胞培养、免疫治疗等领域的高品质耗材及定制化服务。
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