|
一、传代培养概念 当培养的细胞增殖达到一定密度后，将会出现密度抑制现象，表现为细胞的生长和分裂速度逐渐减慢，甚至停止。贴壁细胞会在培养瓶中长成致密单层 (悬浮细胞会充满整个体积的培养液)，铺满培养瓶底部，此时如果不及时进行分装再培养，即传代培养，细胞将逐渐走向衰老、死亡，将培养的细胞从一个容器以适当比率转移到其他容器中扩大培养，称为传代培养。
贴壁细胞：该类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长，繁殖；当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞性或上皮样细胞；其生长过程分为游离期、贴壁期、潜伏期、对数期、平台期和衰退期。  悬浮细胞（suspension cell ）：不贴附于生长物，细胞呈圆形，呈单个细胞或者细小细胞团，悬浮细胞生长空间大，传代方便，能够大量增殖。  因此，细胞的传代培养也被分为两类 1、贴壁细胞的传代培养  加培养液终止消化后加入步骤——1000rpm离心3min——离心——新鲜培养基重悬细胞——随后进行——计数——最后分装 详细步骤如下： ① 首先倒掉培养基，在这一步骤可以收集一些细胞上清做支原体检测 ② 加入胰蛋白酶，一般T25是＋2mL，盖好瓶盖，摇晃T25培养瓶，使胰蛋白酶均匀覆盖在细胞表面，放入培养箱2-3min，期间可在显微镜下观察，看到大部分细胞变圆，即可放入超净台，加入2倍的完全培养基，这里就是加4mL培养基，终止消化 ③ 将含有胰蛋白酶，细胞和培养基一起转移到离心管中，1000rpm/3min离心，去掉上清 ④ 新鲜的完全培养基重悬，根据细胞的生长特性和后续的实验需求进行传代，比如我养的Hepa1-6就长的比较快，不是着急用的话，我就会按1E6个细胞/T75培养瓶进行传代；但如果后两天要用，就会适当多传一点 ⑤ 还可通过显微镜计数后，直接用于细胞铺板，继续后续的实验 2、悬浮细胞的传代培养 ① 离心全换液法：通过离心（800-1000rpm，5min）去除全部旧的培养基，更换新鲜培养基；该方法适合“皮实“好养的悬浮细胞换液(如K562)，或当前细胞状态良好、密度较高导致培养基消耗较大的情况；换液彻底，能去除部分细胞碎片，但会对细胞造成一定程度的机械损伤 ② 离心半换液法：通过离心（800-1000rpm，5min）50%细胞悬液，更换50%体积的新鲜培养基。该方法适合比较“矫情“难养的细胞（如THP-1），或正在调整状态中、密度较低但碎片较多需要去除的情况 ③ 沉降换液法：利用重力自然沉降，将培养基与细胞分离，达到全部或部分更换为新鲜培养基；只适合能成一定大小细胞团（否则无法自然沉降，只能低速离心）的细胞，尤其是处理依赖细胞聚集才能增殖的细胞，如NK-92、Jurkat；可最大限度避免离心过程造成的机械损伤，同时保留聚集的细胞团 三、细胞传代注意事 ① 细胞操作的所有过程都需遵守无菌操作； ② 细胞长到85-90%左右就可以考虑传代 ③ 细胞重悬时，尽量吹散，尤其是容易结团的细胞，比如HepG2细胞，结团率过高影响细胞的活率和生长 ④ 不管是贴壁/悬浮细胞，吹打时动作轻柔，避免产生气泡 ⑤ 每次移液后需及时更换枪头，避免造成溶液交叉污染 ⑥ 贴壁细胞用胰酶消化时，需严格控制消化时间 ⑦ 选择适合的传代比例，保证细胞在使用时是处于良好的生长状态 ⑧ 尽量使用一次性无菌移液管，减少污染的风险 附：  |
|
|
