臭氧处理过后的蓝莓果实，在贮藏期间抗氧化防御系统的变化

前言

臭氧是一种具有强氧化性的试剂，许多研究表明，臭氧可以有效地用于扩大浆果的商业价值，包括确保微生物安全以及储存产品的高营养和加工价值。

研究表明，臭氧浓度为15 ppm的臭氧处理30分钟，每12小时，在寒冷条件下 (4°C ) 储存 28 天，可显著减少蓝莓果实中真菌和需氧细菌的生长。

存放 28 天后，灰霉菌（Botrytis cinerea) 对照水果达到27.5%，而在臭氧化样品中没有观察到症状。

此外，臭氧化还抑制了抗坏血酸和类黄酮等抗氧化的一系列化合物，在储存过程中的损失。

随后，研究人员又用臭氧处理，对冷藏（4°C）期间蓝莓果实氧化应激标志物，进行了标准性质的水平测试，从而得出了蓝莓果在抗氧化防御中的一系列变化。

研究历程

蓝莓( Vaccinum corymbosumL.)水果以15 ppm的臭氧浓度进行臭氧处理 30 分钟，每12小时一次，在4°C下储存28天。

结果表明，臭氧处理激活了蓝莓果实抗氧化应激的防御机制。

在储存的前21天，臭氧化水果的特点是抗氧化酶（即超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶）的活性高于未臭氧化水果。

反过来，与未处理的材料相比，经过臭氧处理的水果中超氧阴离子自由基和过氧化氢的水平显著降低。

然而，在储存 21 天后，臭氧处理有助于蛋白质的氧化修饰，这可能是酶活性降低的原因，涉及细胞保护免受氧化应激。

例如，经过7天的储存后，臭氧化水果中类黄酮和花青素的总含量没有显着变化，而对照水果则分别降低了约20%和32%（Piechowiak 等人结论，2019 年）。

奈何，水性介质中的臭氧会迅速分解成活性氧 (ROS)，如超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟基自由基，过量的话对植物有毒。

而ROS 作为一个非常活泼的个体会引起生物分子的氧化，这对细胞的正常功能很重要。

即蛋白质、脂质和 DNA，蛋白质的氧化修饰导致其生物学特性的丧失，而脂质膜中不饱和脂肪酸的过氧化增加会导致其结构受损，从而导致细胞膨胀减少和细胞死亡（Cai 和 Yan 2013 ；Moller 等人）等人2007)。

此外，植物细胞中高水平的 ROS 与多酚氧化酶的活性密切相关，多酚氧化酶是果实在贮藏过程中发生酶促褐变和多酚化合物损失的原因（Sachadyn-Król 等人，2016 年）。

但在水果加工和储存的背景下，它会导致感官属性、营养价值和硬度变差，以及水果对机械损伤和微生物污染的敏感性增加（Giongo等人，2013年；Jin等人，2017年）。

所以，研究人员为了充分说明臭氧处理对蓝莓果实贮藏品质的塑造作用，有必要确定臭氧处理对果实氧化应激标志物水平的影响。

于是，在数十位研究人员的共同努力下，他们对臭氧处理和非臭氧处理蓝莓果实在贮藏过程中的活性氧 (ROS) 水平、抗氧化酶活性和蛋白质氧化损伤水平进行了再一次的深入研究。

研究材料是从当地种植园购买的Bluecrop品种的新鲜蓝莓（Vaccinum corymbosum L.） 果实。

蓝莓完全着色，可以食用，没有发霉的迹象。在开始实验之前，对蓝莓进行了大小均匀且没有机械损伤的筛选。

根据Piechowiak等人提出的程序，使用浓度为15 ppm（气体流速，4 m s -1）的气态臭氧对蓝莓进行臭氧处理30分钟，在整个储存期间以12小时为间隔。

然后，再使用臭氧发生器（CSI，Ekotech，波兰）和臭氧分析仪UV-106 M（2B Technologies，美国）进行臭氧化。蓝莓（对照样品和臭氧化样品）在4°C（90–95% 相对湿度）的冷却室中储存 28 天。

并且，储存实验一式三份开始进行。

在储存0、7、14、21和28天后收集用于分析的样品（臭氧化水果和对照水果），并保存在- 67°C。

将蓝莓 (5 g) 用25 mL 50%甲醇溶液均化，将匀浆摇动30分钟（150 rpm）并通过以7500 g离心10分钟澄清。

获得的上清液用于使用ABTS自由基测定抗自由基活性，根据 Biskup 等人提出的分光光度法测定，结果表示为每 1 g 蓝莓干物质中槲皮素的毫克数。

除此之外，研究人员还开发出一种谷胱甘肽含量的测定。

将冷冻蓝莓组织（5 g，−67°C）研磨并在冰浴中与15 mL含有5 mMEDTA的冷冻100 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）一起匀浆。

然后，再将匀浆在4°C下以15000 g离心15分钟，将获得的上清液用于谷胱甘肽 (G-SH) 含量测定，使用邻苯二甲醛荧光测定法。

结果表示为每 1 g 蓝莓组织干质量中 G-SH 的 μmol （Bartosz 2006 ）。

至于水果中活性氧水平的测定，研究人员用20 mL冷冻的100 mM磷酸钠缓冲液 (pH 7.4) 将蓝莓果实 (5 g) 均质化。

将匀浆在4°C下以15000 g离心15分钟，并将上清液用于ROS水平测定。

基于O 2 -·还原硝基蓝四唑(NBT)的能力和产生的甲臜的分光光度检测(ΔA min -1 g -1 )，确定超氧阴离子自由基(O 2 - · )水平。

过氧化氢(H 2 O 2 )水平用 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H 2 DCF-DA)估算。H 2 DCF-DA 被细胞内酯酶水解形成 2',7'-二氯二氢荧光素，后者被H 2 O 2氧化成荧光 2',7'-二氯荧光素 (DCF)。

结果表示为 1 分钟内荧光的增加 (ΔF min -1 g -1 ) (Bartosz 2006 )。

随后，研究人员又对蓝莓蛋白中的巯基进行了最终测定。

冷冻蓝莓组织 (5 g) 在冰浴中与 15 mL 冷冻的 50 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0) 一起匀浆。

将匀浆摇动 10 分钟（150 rpm），然后在 4 °C 下以 7500 g离心15 分钟。使用 PVPP 过滤从酚类化合物中纯化上清液，并与冷丙酮混合（1:4，v/v）。

之后，将混合物在 - 20 °C 下孵育 2 小时，并通过以 14,000 g离心20 分钟沉淀。

接着，将沉淀重悬于 50 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0) 中，并使用 Ellman 方法测定蛋白质样品中 -SH 基团的水平。

结果表示为样品中每 1 g 蛋白质的 -SH 基团的毫摩尔数 (Bartosz 2006 )。

最终，研究人员得出数据，氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx，1.11.1.9）等抗氧化酶是真核细胞抵御氧化应激的第一道防线。

而SOD 催化超氧阴离子自由基的清除，导致过氧化氢和分子氧的形成，而谷胱甘肽过氧化物酶在还原型谷胱甘肽存在下加速过氧化氢还原为水（Cai 和 Yan 2013 ）。

如图 A 和 B所示，经过臭氧处理的果实中 SOD 和 GPx 的活性在 7 天后急剧升高，并保持在较高水平，直至贮藏第 21 天（p  < 0.05），随后这些酶的活性显着降低。

Boonkorn 等人也注意到了类似的关系（2012 年），确定了臭氧处理（臭氧浓度，400 μL L −1）2、4 和 6 小时对橘子果实在 25 °C 下储存 3 天前的微生物污染和抗氧化状态的影响。

他们发现，在整个储存期间，SOD 和参与过氧化氢清除的酶（过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶）的活性在臭氧化后增加，并且显着高于对照。

可能是水中臭氧衰变过程中产生的活性氧激活了负责中和 ROS 的酶。

因此，超氧阴离子自由基水平的增加会增强超氧化物歧化酶的活性，而较高浓度的过氧化氢会激发产生 H 2 O的酶2中和到更高的活性。

而在这项研究中，数据清楚地表明，臭氧处理过的水果在整个储存期间的 ROS 水平低于未处理的材料（图 2A、B）。

这可以通过更高的中和细胞中产生的活性氧的能力来解释，因为它们的酶促装置和更高水平的低分子量抗氧化剂。

此外，使用 ABTS ·+测试的抗自由基活性证实了臭氧化水果具有更高的自由基中和能力（图2C）。

这一观察结果与 Xu 等人一致。（2019）。作者使用浓度为 0.68 mg L −1的气态臭氧进行臭氧处理10 分钟，以提高香菜在室温下储存前的采后品质。

他们指出，臭氧化抑制了香菜中O 2 ·−和H 2 O 2的积累，这与较高的过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶活性有关。

然而，在此次的研究中，经过处理的材料在储存 21 天后的 ROS 水平高到足以降低保护植物免受 ROS 作用的自然防御机制。

这段时间后，研究人员观察到 SOD、GPX 和 PAL 活性显着降低，以及与 ABTS ·+ 反应的低分子量抗氧化剂浓度降低。

而穆勒等人( 2007) 报告说，氧化应激的负面后果之一是蛋白质的氧化修饰，包括酶和改变其性质。

在这项研究中，从水果中分离出的蛋白质中硫醇基团的水平被选为蛋白质氧化损伤的标志。

研究人员注意到，从臭氧化水果和对照水果中提取的蛋白质中硫醇基团的水平在储存的前 21 天没有显着变化（图1D）。

然而，在此之后，-SH 组在臭氧化水果蛋白中的水平显着低于对照样品。

结语

本研究证明了在富含臭氧的大气中贮藏后，蓝莓果实中活性氧水平与抗氧化应激的天然防御机制之间的关系。

在储存的前 21 天，臭氧化水果的特点是抗氧化酶（即超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶）的活性高于未臭氧化水果。

反过来，由于 ROS 解毒系统的活性提高，臭氧处理过的水果中超氧阴离子自由基和过氧化氢的水平显着低于未处理的材料。

然而，在储存 21 天后，臭氧处理有助于蛋白质的氧化修饰，这可能是酶活性降低的原因，涉及细胞保护免受氧化应激。

参考文献：

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