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位于c-MYC的P1启动子上游的核酸酶超敏元件III1(NHEIII1)参与了80%～90%的c-MYC转录。在一定条件下，NHEIII1元件富含的鸟嘌呤(G)的重复序列可形成特定的非经典DNA二级结构，称为G-四链体（G4）。G4可作为一种基因沉默元件负向调节c-MYC转录，因而开发能够稳定c-MYC G4的小分子靶向配体拥有巨大的肿瘤治疗前景[1]。目前已有多种c-MYC G4配体的报道，c-MYC G4小分子配体根据其化学结构大致可分类为大环类、玫瑰树碱衍生物、吖啶衍生物、喹叨啉衍生物、咔唑衍生物、Triangulenium衍生物、苯并呋喃衍生物、二萘嵌苯和六苯并苯衍生物、槲皮苷和小檗碱衍生物、萘胺衍生物、噻唑聚酰胺、脯氨酰胺衍生物、吲哚嗪酮衍生物、碱基衍生物、三嗪衍生物、有机-金属配合物[2]。然而，c-MYC G4特异性配体以及选择性c-MYC转录抑制剂的缺乏限制了临床候选药物的进一步开发。虽然G4结构在众多启动子中普遍存在，但其在四分体堆栈的数量以及连接四链体的环的长度以及碱基组成方面的差异使得特异性靶向配体设计有据可循[1]。2023年4月，Journal of Medicinal Chemistry杂志报道了中山大学药学院谭嘉恒教授课题组的工作，关于新型强效选择性c-MYC转录抑制剂-苯并硒唑类化合物的开发与表征[3]。  图2 苯并硒唑类c-MYC转录抑制剂
研究者针对苯并唑类结构进行药物化学探索，共设计合成了24种衍生物，并探究不同修饰策略对衍生物活性的影响。修饰策略其一是通过将苯并唑杂环的氮进行季铵化对分子引入正电荷；并将芳环体系融入咔唑，以期增强衍生物与c-MYC G4的相互作用。进一步的，又将苯环融合到苯并唑中，拓展更大的芳环体系。另外的修饰策略是在咔唑片段引入不同侧链以期提高其与c-MYC G4的凹槽和环区域的结合。荧光光谱法检测衍生物与6种代表性DNA寡核苷酸的结合强弱的SAR：苯并唑基团上引入正电荷会增强衍生物与c-MYC G4的结合；苯并唑杂环上硒元素的引入有利于增加化合物的亲和力与特异性；苯并唑额外融合的苯环改善衍生物与pu22结合的同时也可能增加与其他DNA的堆叠相互作用；咔唑片段引入氨基侧链显著增加了衍生物与双链ds26的结合。化合物m-Se1和化合物m-Se3是优选的c-MYC G4特异性配体。细胞毒性实验（MTT）结果显示，m-Se1和m-Se3对癌细胞具良好选择性。m-Se1和m-Se3选择性结合并稳定c-MYC G-四链体荧光滴定实验测定化合物m-Se1/m-Se3对c-MYC G4 pu22的表观解离常数（Kd）（m-Se1：0.4 μM和m-Se3：0.9 μM）远高于对其他5种DNA的Kd（大多>20μM），且化合物m-Se3对pu22的选择性略高于m-Se1。CD melting实验在体外验证了化合物m-Se1和m-Se3能够提高c-MYC G4的热稳定性。m-Se1和m-Se3显著抑制c-MYC转录RT-PCR实验表明化合物m-Se1和m-Se3可以有效地抑制c-MYC的转录。Western blot实验指征化合物m-Se1和m-Se3能以剂量依赖的方式降低c-MYC的蛋白水平。
图7 RT-PCR结果与Western blot数据m-Se3与c-MYC G4 的对接模型研究者使用薛定谔软件对化合物m-Se3与c-MYC G4进行分子对接研究。化合物m-Se3的咔唑片段堆叠在G4上方。在c-MYC G4的3’端结合位点中，化合物m-Se3的带正电荷的季铵氮原子朝向离子通道。在c-MYC G4的5’端结合位点中，化合物m-Se3苯并硒唑的硒原子可能和邻近的腺嘌呤碱基形成氢键与硫键相互作用。m-Se3通过破坏NM23-H2/c-MYC G4相互作用特异性抑制c-MYC转录外显子特异性实验表明化合物m-Se3对外显子1的转录中显示出剂量依赖性抑制，而对外显子2转录几乎没有影响。ELISA实验显示化合物m-Se3可以有效抑制NM23-H2与c-MYC G4的结合，IC50值为9.8μM。ChIP实验观察到用2.1μM m-Se3处理HepG2细胞能导致单链结合蛋白NM23-H2与c-MYC DNA的显著解离。值得一提的是，化合物m-Se3对其他几种启动子还含有G4的癌基因（VEGF，c-KIT，KRAS和NRAS）的转录几乎没有影响。 图9 m-Se3破坏NM23-H2/c-MYC G4相互作用并特异性抑制c-MYC转录集落形成实验显示，化合物m-Se3几乎完全抑制HepG2细胞的增殖。流式细胞术测定结果m-Se3以剂量依赖性方式诱导S期细胞的明显积累、诱导细胞凋亡。RNA-seq数据指征化合物m-Se3调控广泛的基因网络，其中196个MYC靶基因大多都被下调。GSEA显示，标志性MYC靶基因在化合物m-Se3处理后显著下调。KEGG核糖体通路等是化合物m-Se3处理后最显著富集的下调基因组。图10 m-Se3抑制c-MYC转录阻断癌细胞生长并调控广泛基因网络m-Se3抑制小鼠异种移植模型中肿瘤的生长研究者使用人肝癌异种移植小鼠模型评估化合物于体内的抗肿瘤作用。实验结果显示给药m-Se3后，肿瘤的体积和重量都随给药时间增长而显著减小。给药组与对照组的小鼠体重无显著差异。免疫组学实验印证，肿瘤组织中的c-MYC表达在给药m-Se3后显著降低。尽管本项工作尚未阐明硒元素对m-Se3功效中活性与特异性的贡献，但研究者证实了苯并硒唑支架在设计新型G4配体的c-MYC转录抑制剂方面的巨大潜力。对m-Se3及其衍生物的进一步研究将有助于揭示更多关于含硒化合物与c-MYC G4相互作用的信息。[1] Brooks TA, et
al. "Targeting MYC expression through G-Quadruplexes." Genes Cancer
1.6 (2010): 641-649. DOI: 10.1177/1947601910377493[2] Ritapa
Chaudhuri, et al. "Recent Update on Targeting c-MYC G-Quadruplexes by
Small Molecules for Anticancer Therapeutics" Journal of Medicinal
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Chemistry 66.8 (2023): 5484-5499. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01808
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