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1.apCAFs来源于间皮细胞作者之前通过单细胞RNA测序对多个胰腺癌的基因工程小鼠模型（正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC [Kras LSL-G12D/+ ;Trp53 fl/fl ;Pdx1 Cre/+ ]）进行了分析，并在正常胰腺和早期PDA中鉴定出三个成纤维细胞群体（FB1、FB2和FB3），晚期PDA中鉴定出两个成纤维细胞群体。为了了解这些模型中成纤维细胞之间的关系，作者将来自正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC的所有成纤维细胞投影到一个t分布随机邻域嵌入，并进行基于图的聚类。作者鉴定出四个成纤维细胞的分子亚型。其中两个亚型代表了作者之前所描述的FB1和FB2，而之前鉴定的FB3群体进一步分为两个不同的亚型，作者将其命名为FB3A和FB3B。有趣的是，FB3B在所有晚期的基因工程小鼠模型中特异性扩增。作者随后调查了FB3A和FB3B的转录谱，并发现每个亚型都表达了MHC II途径（Cd74，H2-Aa，H2-Ab1，H2-Dma，H2-Dmb1，H2-Eb1）和间皮细胞（Msln，Upk3b，Ezr，Krt19，Nkain4，Lrrn4）基因。然而，与FB3A相比，FB3B显示出较低水平的间皮标记基因表达，并增加了炎症和肌成纤维细胞（Il6，Cxcl12，Pdgfra，Acta2，Thy1，Tgfb1）基因的表达。这些数据表明，FB3A和FB3B都是间皮细胞，其中FB3A是正常的间皮细胞，而FB3B是具有成纤维细胞表型的间皮细胞。 2.在胰腺癌（PDA）的进展过程中，间皮细胞扩增并参与到纤维增生中为了验证转录组学的发现，作者进行了免疫组化染色，使用了特异性标记的介质细胞。然而，作者注意到大部分介质标记物，如介质素，在apCAFs中表达水平较低。尽管如此，作者还是找到了一些特异性标记介质细胞和成纤维细胞，并且在介质细胞向apCAF转变过程中保持稳定的标记物。其中一个标记物是podoplanin，据报道是一种泛CAF标记物。另一个标记物是cadherin-11。在正常小鼠胰腺组织以及早期和晚期KPfC肿瘤中，对podoplanin、cadherin-11和介质素进行的IHC染色显示，在正常胰腺中，介质层被这三种蛋白标记。在早期肿瘤病变中，podoplanin和cadherin-11标记了扩张的介质细胞，这些细胞对早期肿瘤病变的间质反应起到了贡献。相比之下，介质素未能标记早期PDA病变中的脱层介质细胞。此外，作者发现在晚期PDA中，介质层仍然呈podoplanin和cadherin-11阳性。为了调查腹膜细胞是否也参与了其他肿瘤环境中的基质形成，作者使用从KPfC肿瘤中获得的一株原代小鼠PDA细胞系建立了一个PDA的原位模型。植入后1周收集小鼠胰腺，捕捉到早期肿瘤病变。通过cadherin-11的免疫组化染色发现，与未涉及正常胰腺周围的cadherin-11 + 腹膜相比，与肿瘤相邻的cadherin-11 + 腹膜扩展并参与了肿瘤基质的形成。由于podoplanin和cadherin-11也标记其他成纤维细胞群体，作者对早期和晚期KPfC肿瘤进行了podoplanin + CD74 + 多重免疫组化染色以标记腹膜细胞。作者发现podoplanin + CD74 + 腹膜细胞形成了一层薄膜，覆盖在胰腺边缘，这些细胞参与了早期肿瘤病变的肿瘤微环境。晚期肿瘤的免疫组化染色表明，腹膜细胞发展成为肿瘤基质中的主要成纤维细胞群体。
3.伤口相关的肿瘤旁分泌信号诱导间皮细胞向成纤维细胞样肿瘤相关腹膜细胞的转变为了验证间皮细胞-apCAF转变的有效性，并在PDA进展过程中确定间皮细胞的命运，作者利用了一个由间皮细胞特异基因Wt1启动的诱导性Cre-loxP系统。类似的系统先前已被用于证明在其他疾病情况下，如肝脏和肺纤维化中，间皮细胞会产生成纤维细胞。作者建立了一个Wt1 CreERT2 ;R26 LSL-tdTomato 模型。Wt1 CreERT2/+ ;R26 LSL-tdTomato/+ 小鼠在Wt1基因位点表达Cre-ERT2融合蛋白。CreERT2在甲氧苄胺（TAM）处理后从R26位点剪切LSL序列，从而不可逆地诱导tdTomato表达。作者将TAM注射到Wt1 CreERT2 ;R26 LSL-tdTomato 小鼠体内，并在最后一次TAM注射后的第5天收集胰腺。作者发现正常胰腺的间皮组织表达tdTomato。作为阴性对照，没有Wt1 CreERT2 的R26 LSL-tdTomato 小鼠在TAM注射后没有tdTomato表达（图3E）。接下来，作者追踪了PDA进展过程中间皮细胞的命运。在Wt1;R26小鼠的胰腺中将中皮细胞标记为tdTomato后，作者向其正位注射了源自KPfC小鼠的同基因PDA细胞系。作者在植入后3周收获了成熟的肿瘤。作者发现中皮细胞在PDA中大量扩增，tdTomato细胞分布在肿瘤的外围和内部。此外，作者注意到在正常胰腺中，中皮细胞不表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）和白细胞介素-6等成纤维细胞标记物，而在PDA的基质中可以看到tdTomatoαSMA或tdTomatoIL-6细胞。这个中皮细胞谱系追踪实验提供了强有力的证据，证明中皮细胞获得成纤维细胞特征，并对PDA的基质形成起贡献作用。 4.间皮细胞-apCAF转化通过一个间皮细胞系重现为了调查体内肿瘤微环境是否能够诱导PanMeso细胞中的apCAF表型，作者共同注射了eGFP-PanMeso细胞和一种原代KPfC细胞系。作为对照，作者也单独注射了癌细胞。注射后1个月，作者收集了肿瘤并将其消化成单细胞悬液。通过荧光激活细胞分选，作者收集了GFP + 细胞，并对其进行转录组分析。作者发现，从肿瘤中分选出的GFP + PanMeso细胞与亲本PanMeso细胞相比，具有间皮细胞基因的下调和成纤维细胞基因的上调。作者对分选出的GFP + 细胞中差异上调的基因进行了通路和功能富集分析，发现其涉及的生物过程与之前的单细胞转录组测序分析相似，包括伤口愈合和炎症反应。作者进一步对肿瘤进行了eGFP和αSMA或IL-6的免疫组化染色。作者发现，TME诱导eGFP + PanMeso细胞表达αSMA和IL-6。综合来看，使用PanMeso细胞的体外和体内数据重现了间皮细胞的成纤维转变，并强调了肿瘤旁分泌信号在促进这一过程中的重要性。
5.apCAFs诱导原始CD4+ T细胞转化为调节性T细胞专业抗原呈递细胞上缺乏共刺激分子可能导致T细胞无能或调节性T细胞的诱导。Tregs是CD4 T细胞的一个亚群，对免疫耐受至关重要。它们也是癌症免疫逃逸的推动因素。因此，作者测试了apCAFs诱导Treg形成的假设。作者检查了与OVA负载的apCAFs共培养的CD4 T细胞中CD25 FoxP3 Tregs的存在。作者发现apCAFs以特异性抗原的方式诱导Treg形成。apCAFs的Treg诱导能力几乎与肿瘤相关的抗原呈递细胞一样高效。此外，作者检查了Tregs中增殖标记物Ki67的表达，并发现CD25 FoxP3 Ki67 Tregs在apCAFs的作用下增加。 为了验证由apCAFs诱导的Tregs的免疫抑制功能，作者进行了Treg抑制实验。首先，作者将原始OT-II CD4 T细胞与apCAFs共培养，有无OVA肽的情况下。然后，未诱导的CD4 T细胞（无OVA）和iTregs（有OVA）与CFSE标记的CD8 T细胞共培养，并进行流式细胞术分析。作者发现，iTregs显著抑制了CD8 T细胞的增殖，证明了CD8 T细胞的抑制功能。综上所述，这些数据表明apCAFs可能是一种独特的免疫调节CAF群体，可以通过抗原依赖的TCR连接诱导Treg的形成和扩增。 6.apCAFs存在于人类肿瘤中，并与Tregs相关为了展示apCAFs的人类相关性，作者收集了33名PDA患者的肿瘤组织队列，并对apCAFs和Tregs进行了多重染色。在这个实验中，作者利用了标记物血小板源性生长因子受体α，它被除了正常间皮细胞以外的所有CAF群体表达。因此，PDGFRα + CD74 + 细胞特异性地突出显示了apCAFs，而PDGFRα + CD74 − 细胞突出显示了其他CAF。作者发现，人类PDA中apCAFs的百分比是不均匀的，从约0%到约35%不等。尽管存在这种不均匀性，作者发现apCAFs与PDA患者的Tregs显著相关，而其他CAF没有相关性。在最近的一项研究中，也发现了非小细胞肺癌中的MHC II + CAFs。为了检查这些MHC II + CAFs是否与胰腺apCAFs相似，作者在两个人类PDA和卵巢癌的单细胞RNA测序数据集中评分了MHC II + CAFs的特征，这些特征是由.报道的。作者发现，来自.的肺部MHC II + CAFs的特征在PDA中标记了apCAFs，但在卵巢癌中标记了iCAFs和仅有一小部分的apCAFs。对免疫组分的额外分析表明，.的MHC II + CAF特征还突出了髓系细胞，而作者的apCAF特征中没有观察到这一点。综上所述，这些数据支持了人类肿瘤中存在apCAFs的存在，并且证明了作者分析得出的特征确实标记了不同物种和其他肿瘤类型中的apCAF群体。然而，这些数据还表明，在一些器官中，如肺部，apCAFs可能不特定于中皮细胞系，正如.所建议的，肺泡II型细胞可能是肺部MHC II + CAFs的另一个起源细胞。 7.IL-1和TGFβ信号通路负责引发apCAFs的诱导为了确定驱动中皮细胞向apCAF转变的信号通路，作者提取了在apCAFs中上调的差异基因，并对其进行了基序富集分析。apCAFs的基因表达谱受核因子κB信号通路或转化生长因子β信号通路的驱动。这些数据非常相关，因为这两个信号通路已被证明是PDA中CAF异质性的主要驱动因素。NF-κB信号通路可以由IL-1诱导，预测其负责iCAF谱系的形成，而TGFβ预测在PDA进展过程中驱动myCAF谱系的形成。为了验证这一结果并测试这两个信号通路是否也负责驱动中皮细胞分化为apCAFs，作者用PDA器官样CM处理了PanMeso细胞，并发现NF-κB信号通路和TGFβ信号通路被激活。作者还检查了IL-1和TGFβ是否驱动中皮细胞表现出apCAF表型。作者用IL-1、TGFβ或两种因子的组合处理了PanMeso细胞，并通过qPCR研究了产生的基因特征。作者发现，无论是IL-1还是TGFβ都能显著下调间皮细胞基因的表达。相比之下，Cdh11和Pdpn没有下调，这支持了作者之前的发现，即这两个基因是间皮细胞-apCAF和其他CAF谱系的稳定标记。相比之下，作者发现纤维母细胞基因在IL-1或TGFβ的作用下有不同程度的上调。例如，一些基因只被IL-1上调，一些被TGFβ上调，一些可以被任一因子上调，而一些则依赖于两种因子的存在。综上所述，这些qPCR数据表明IL-1和TGFβ可以将正常的间皮细胞转化为具有apCAF表型的纤维母细胞。
8.抗间皮细胞转化为肺间质细胞的转变可以被抗间皮素抗体抑制虽然IL-1和TGFβ会引发间皮细胞向apCAF的转变，但这两个信号在iCAF和myCAF群体的形成中也起着重要作用。它们还会影响癌细胞和其他基质细胞的许多生物过程。此外，TGFβ被认为是一种肿瘤抑制因子。因此，IL-1和TGFβ可能不适合作为特定抑制间皮细胞向apCAF转变的目标。最近，有两项研究报道了间皮细胞在手术粘连和肝纤维化的小鼠模型中对成纤维细胞形成的贡献。在这两项研究中，使用了针对间皮细胞标记物间皮素的小鼠特异性阻断单克隆抗体来抑制间皮细胞向成纤维细胞的转变。结果，在这两种疾病情况下，纤维化表型显著减轻。因此，作者测试了相同抗体对间皮细胞向apCAF的影响。作者用KPfC PDA器官样细胞培养基处理PanMeso细胞，分别加入对照抗体或MSLN Ab，然后进行qPCR实验。MSLN抗体的治疗显著抑制了由PDA器官样体细胞培养基引起的中皮细胞基因的下调和EMT及成纤维细胞基因的上调。为了验证这种效果在体内的作用，作者进行了中皮细胞谱系追踪研究，并使用MSLN抗体进行治疗。在TAM诱导后，Wt1;R26小鼠接受了对照抗体或MSLN抗体的治疗，然后正位植入PDA细胞。在PDA进展期间，继续使用对照抗体或MSLN抗体进行治疗。作者发现，MSLN抗体治疗显著降低了TAM诱导的Wt1;R26小鼠中tdTomato细胞的百分比。此外，由αSMA和IL-6标记的中皮细胞的成纤维细胞特征也显著减少了。这些数据表明，通过靶向MSLN可以抑制中皮细胞向成纤维细胞激活状态的转变，无论是体外还是体内。
至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先详细的介绍了癌症相关成纤维细胞中的一种独特种群——抗原呈递CAFs 的特征；第二部分描述了它们在胰腺癌中的免疫调节作用；第三部分探讨了间皮细胞如何转化为apCAFs并影响肿瘤免疫；第四部分叙述了基于apCAFs的免疫治疗策略，以及未来的治疗方向。全篇内容深入，为作者揭示了胰腺癌中的免疫逃逸机制，对于致力于肿瘤免疫治疗的研究者来说是一篇不容错过的好文章！ |
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