动物生理学实验报告
实验五：血液凝固及其影响因素
实验人： 同组人：
【实验目的】
1． 学习血液凝固的基本过程
2． 了解加速或延缓血液凝固的一些因素
【实验原理】
血液凝固是一个酶的有限水解激活过程，在此过程中有多种凝血因子参与。根据凝血过程起动时激活因子来 源不同，可将血液凝固分为内源性激活途径和外源性激活途径。内源性激活途径是指参与血液凝固的所有凝血因 子在血浆中，外源性激活途径是指受损的组织中的组织因子进入血管后，与血管内的凝血因子共同作用而启动的
激活过程。
【实验材料和用具】
家兔
清洁小试管7 个、小烧杯2 个、竹签、秒表、试管架、哺乳动物手术器械一套、兔手术台、动脉夹、塑料动脉插
管、线、棉花、水浴槽、冰盒
液状石蜡、肝素、草酸钾1~2mg、脑匀浆液0.1ml、生理盐水
【实验过程】
1、 动物麻醉及颈部手术 （此部由助教老师操作）
取一只动物，称重。按1g/kg 体重的剂量将乌拉坦（氨基甲酸乙酯）由耳缘静脉缓慢注入，观察动物肌张力、
呼吸与角膜反射的变化。动物麻醉后背位固定于兔手术台上。
剪去颈部手术野的毛，沿颈正中线在喉头上一指至锁骨上一指的地方作一5～7cm 的皮肤切口。分离皮下组
织及肌肉。
2、 颈总动脉插管（此部由助教老师操作）
在气管两侧辨别并分离颈总动脉，颈总动脉下方穿两条线备用。在左侧颈总动脉的近心端夹一动脉夹，在动
脉夹远心端距动脉夹约3cm处结扎。 小剪刀在结扎线的近侧 结扎线与动脉夹之间） 向心方向剪一小斜口 约
用 （ 沿 （
占管径的一半），向心脏方向插入动脉插管，由备用的线结扎固定。取血时将动脉夹松开即可。
3、 血液凝固的加速和延缓观察
1.
2.
3.
4. 5. 6.
打开兔颈总动脉夹，血液从动脉插管流出，弃去第一份1mL动脉血后，向每个试管中注入1mL兔动
脉血，并摇匀。
自血液流出动脉插管开始计时。除第1 管外，其他各管每隔15 秒钟将试管倾斜一次，观察液面是否
倾斜即血液是否流动，直到试管内血液不再流动为止，记录凝血时间。
当第2 管已经凝固时，再倾斜第1 管看血液是否凝固，若尚未凝固则按上述方法每隔15 秒钟倾斜一
次，直到血液凝固为止，记录凝血时间，即为该兔血的凝固时间。
以第2 管为对照，各管观察其他各管中血液凝固时间。
向第9 管中滴加2％氯化钙2 滴，观察血液是否凝固。
取出第5 管中的玻棒，用水洗净，观察附着在玻棒上的纤维蛋白。
注意事项：
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a) b) c) d)
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取放试管时要用拇指和食指捏住试管的上端，不要握住试管的底部，以免手的温度影响结果。
每支试管口径及采血量要尽量一致，不可相差太大。
记录凝血时间要准确。
判断凝血的标准要前后一致。一般以倾斜试管达45?时，试管内血液不见流动为准。
【实验结果及相关讨论】
管号
实验条件
凝血时间 凝血时间 （一组） （二组）
现象解释
肝素是抗凝剂，能不可逆的阻止血液凝固。由于肝素钠 具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环 节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，
主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，而增强后者对
加入0.1％肝素溶液 大于 大于 活化的Ⅱa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa 和Ⅻa 凝血因子的抑制作用。
1
0.1mL（6 滴） 20min 20min 其后果涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的
形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨
碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。中和组织凝血活素（因子 Ⅲ）。抑制血小板的聚集和释放。它对血中有机成分和
无机成分的测定均无影响。
血液凝固的多个环节中都需要钙离子的参与，故通常用
枸橼酸钠、草酸钠和草酸钾作为体外抗凝剂，它们可与 钙离子结合而除去血浆中的钙离子，从而起到抗凝作
用。 论上当继续向血液中加入CaCl2溶液， 2中的
理 CaCl
加入2％草酸钾溶液 大于
2 钙离子会起到凝血因子 IV 的作用，从而使再次启动凝
0.1mL （6 滴） 20min
血过程，血液凝固。草酸盐是可逆性抗凝剂。但本次实
验中加入 CaCl2后并没有出现凝血现象，可能是 CaCl2
溶液配置有问题，或者由于操作不当，凝血因子已经完
全失活。
室温（6 滴生理盐水） 血液流出血管后，很快会凝固。血液流出血管后血小板
3 7min30s 7min30s
静置
倾斜可加速血小板的粘附聚集过程，并加大血小板释放
室温（6 滴生理盐水）
4 4min 5min 的凝血因子与血细胞的接触面积，从而加快了凝血的过
每隔15S 倾斜45?
程。该过程是内源性凝血过程。
细玻璃粉少许 6 滴生 （ 玻璃粉是异物，可激活凝血因子Ⅶ及血小板，启动凝血
5 2min45s 3min
理盐水） 过程。
脑组织液中有组织因子途径抑制物，是外源性凝血途径
6 脑组织浸出液（6 滴） 15s 30s
的特异性抑制剂，因而能加速凝血过程。
置于40℃水浴（6 滴 适当升高温度，能增加酶的活性，加快凝血过程。
7 165s 165s
生理盐水）
置于10℃水浴（6 滴 大于 降低温度可以降低酶的活性，延缓凝血过程。
8
生理盐水） 20min
有富有弹 在竹签的搅动下，特别是缠上线的接触面粗糙的竹签，
竹签搅拌 6 滴生理盐 性的纤维 （ 能加速凝血过程，使凝血因子按一定顺序相继激活而生
9 同上
水） 蛋白纠缠 成凝血酶，最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白，而纠结在
在竹签上 竹签上，形成一层蛋白膜。
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机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢 失的关键。机体的正常止凝血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能，有效的血小板质量和数量，正常的血浆凝
血因子活性。其中，血小板和凝血因子是生理性止凝血的重要成分,(见图 1)。抗凝系统不仅包括抗凝因子，还包
括纤溶系统。
BT 出血时间 CFT 束臂试验 CRT 血块收缩试验 BPC 血小板计数
CT 凝血时间 RT 复钙时间 APTT 活化部分凝血活酶时间
PT 凝血酶原时间 PF3 血小板第 3 因子 TF 组织因子 Fb 纤维蛋白
TXA2 血栓素 A2 5-HT5－羟色胺 PK 激肽释放酶原 HMWK 高分子量激肽原
图 1 正常止血机制及血栓与止血常用筛选试验检测环节
血小板的作用：
在正常的血液循环中，血小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用，而是沿着毛细血管内壁排列，维持
其完整性，血管局部受损伤时，血小板的止血兼有机械性的堵塞伤口和生物化学性粘附聚集作用。止血时，首先
是受损的血管壁发生收缩，使局部血液流动变慢或减少。血液中的血小板在 vWF 因子存在下迅速粘附于暴露的
胶原纤维，此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚
集(血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 由纤维蛋白原介导发生互相粘附、聚集)，此为血小板第一相聚集，激活的血小板便发
生释放反应和花生四烯酸代谢，其中许多物质，如血小板的 ADP 等，可加速血小板的聚集、变性成为不可逆的
"第二相聚集"，形成白色血栓，构成了初期止血的屏障。与此同时，由血小释放和激活许多促凝物质参与血液
凝固反应。血小板膜磷脂表面提供了凝血反应的场所，血小板第3 因子在凝血过程多个环节中发挥重要作用，血
小板合成释放的TXA2 和5-HT 促使进一步收缩，血小板收缩蛋白则最终可使纤维蛋白收缩(血块收缩)，使血栓
更为坚固，止血更加彻底。
凝血过程：
血液凝固简称凝血，是血液由流动状态变为凝胶状态的过程，它是止血功能的重要组成部分。凝血过程是一
系列凝血因子被相继酶解激活的过程，最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。迄今为止，参与凝血的因子共有14
个。其中用罗马数字编号的有12个(从Ⅰ－Ⅷ，其中因子Ⅵ并不存在)。习惯上，前4 个凝血因子常分别称为纤维
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蛋白原(因子Ⅰ)、凝血酶(因子Ⅱ)、组织因子(因子Ⅲ)和钙离子(因子Ⅳ)。凝血因子VI已知是血清中活化的凝血因
子V，故不再视为一独立的凝血因子。
1．内源性凝血途径
内源性凝血途径是指参加的凝血因子全部来自血液(内源性)。临床上常以活化部分凝血活酶时间(APTT)来反 映体内内源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子Ⅻ激活，到因子X 激活的过程。当血管壁发生损伤， 内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触，因子Ⅻ即与之结合，在HK和PK的参与下被活 化为Ⅻa。在不依赖钙离子的条件下，因子Ⅻa 将因子Ⅺ激活。在钙离子的存在下，活化的Ⅺa 又激活了因子Ⅸ。 单独的Ⅸa 激活因子X 的效力相当低，它要与Ⅷa 结合形成1：1 的复合物，又称为因子X 酶复合物。这一反应
还必须有Ca2+和PL共同参与。
2．外源性凝血途径
外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是
从组织因子暴露于血液而启动，到因子Ⅹ被激活的过程。临床上以凝血酶原时间测定来反映外源性凝血途径的状 况。组织因子是存在于多种细胞质膜中的一种特异性跨膜蛋白。当组织损伤后，释放该因子，在钙离子的参与下，
它与因子Ⅶ一起形成 1：1 复合物。一般认为，单独的因子Ⅶ或组织因子均无促凝活性。但因子Ⅶ与组织因子结
合会很快被活化的因子Ⅹ激活为Ⅶa，从而形成Ⅶa 组织因子复合物，后者比Ⅶa 单独激活因子Ⅹ增强16000 倍。 外源性凝血所需的时间短，反应迅速。外源性凝血途径主要受组织因子途径抑制物(TFPI)调节。TFPI是存在于正 常人血浆及血小板和血管内皮细胞中的一种糖蛋白。它通过与因子Ⅹa 或因子Ⅶa-组织因子-因子Ⅹa 结合形成复
合物来抑制因子Ⅹa 或因子Ⅶa-组织因子的活性。另外，研究表明，内源凝血和外源凝血途径可以相互活化。
3．凝血的共同途径
从因子X 被激活至纤维蛋白形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成
两个阶段。
(1) 凝血酶的生成：即因子Ⅹa、因子Ⅴa 在钙离子和磷脂膜的存在下组成凝血酶原复合物，即凝血活酶，将
凝血酶原转变为凝血酶。
(2) 纤维蛋白形成：纤维蛋白原被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，并交联形成稳定的纤维蛋白凝块，这一过程
可分为三个阶段，纤维蛋白单体的生成，纤维蛋白单体的聚合，纤维蛋白的交联。纤维蛋白原含有三对多肽链，
其中纤维蛋白肽A(FPA)和B(FPB)带较多负电荷，凝血酶将带负电荷多的纤维蛋白肽A 和肽B 水解后除去，转
变成纤维蛋白单体。从纤维蛋白分子中释放出的FPA 和FPB 可以反映凝血酶的活化程度，因此FPA 和FPB 的
浓度测定也可用于临床高凝状态的预测。纤维蛋白单体生成后，即以非共价键结合，形成能溶于尿素或氯醋酸中
的纤维蛋白多聚体，又称为可溶性纤维蛋白。纤维蛋白生成后，可促使凝血酶对因子ⅩⅢ的激活，在ⅩⅢa 与钙
离子的参与下，相邻的纤维蛋白发生快速共价交联，形成不溶的稳定的纤维蛋白凝块。纤维蛋白与凝血酶有高亲
和力，因此纤维蛋白生成后即能吸附凝血酶，这样不仅有助于局部血凝块的形成，而且可以避免凝血酶向循环中
扩散。
在凝血共同途径中有两步重要的正反馈反应，有效地放大了内外源凝血途径的作用。
一是Xa 形成后，可反馈激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ；
二是凝血酶形成后，可反馈激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ、以及凝血酶原。凝血酶还可促使血小板发生聚集
和释放反应，刺激血小板收缩蛋白引起血块退缩。但大量凝血的产生却反过来破坏因子Ⅷ、和因子Ⅴ，这是正常
凝血的负反馈调节，以防止不适当的过度凝血。
抗凝剂的选择：
（1） 草酸钾：常用于尿素、肌酐、纤维蛋白原等测定，不能用钾、钙等测定，对LDH、丙酮酸激酶、AKP 和
淀粉酶有抑制作用。
（2） 肝素：常用于电解质、血气分析、血氨等测定。抗凝剂比例为50～61u 肝素/5ml血。注意钠盐可使淀粉酶
升高。
（3） 氟化钠：常用氟化钠—草酸钠混合抗凝剂作血糖测定的抗凝剂，氟化钠可以抑止烯醇化酶，它可避免血细
胞葡萄糖酵解酶的作用，延长标本的保存时间。
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（4） 二乙胺四乙酸钠盐（EDTA-Na2）：生化常用的抗凝剂，但不能用于钙、钠、及含氮物质的测定，对淀粉
酶、肌酸激酶、AKP、ALP、5''-核苷酸酶等可抑制，对丙酮酸激酶有明显升高的作用。
（5）枸橼酸钠，测定血沉用3.8%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂与血液比例为1：4，凝血试验需用3.2%枸橼酸钠抗凝，
比例为1：9。
（6）实验室使用抗凝剂种类较多， 细胞分析及红细胞比积测定宜用EDTA? 抗凝， 证室温下6 小时RBC
血 K2 保
体积不变，抗凝剂比例为1.0～2.0mg/1ml血。
【参考文献】
生理学 姚泰 人民卫生出版社 动物生理学实验 魏香 清华大学出版社
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