【原】Cephalofurimazine-用于大脑非侵入性成像的优化生物发光基质

Cephalofurimazine：生物发光成像（BLI）允许对体内细胞和生化事件进行非侵入性可视化，因此已成为生物医学研究中不可或缺的技术。然而，中枢神经系统中的 BLI 仍然具有挑战性，因为荧光素酶在现有底物的大脑中表现出相对较差的性能。在这里，我们报告了一种具有改善大脑功能的 NanoLuc 底物头孢呋利嗪 (CFz) 的发现。CFz 与 Antares 荧光素酶配对产生的大脑信号比D的标准组合多 20 倍以上-荧光素与萤火虫荧光素酶。在标准剂量下，Antares–CFz 的亮度与 AkaLuc–AkaLumine/TokeOni 相匹配，而偶尔可以使用更高剂量的 CFz 以获得三倍以上的信号。CFz 应该允许越来越多的基于 NanoLuc 的指标以高灵敏度应用于大脑。使用 CFz，我们在自由活动的小鼠大脑中实现了 Antares 的视频速率非侵入性成像，并展示了基因定义的神经元中感觉诱发活动的非侵入性钙成像。

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主要的

生物发光成像 (BLI) 是一种强大的技术，用于对活体动物中的基因表达、细胞位置和分子事件进行非侵入性纵向追踪1 , 2 , 3。在 BLI 中，荧光素酶（无论是单独表达还是作为报告蛋白的组成部分）氧化化学底物以产生光发射。与荧光成像相比，BLI 不需要激发光，因此不存在厚度依赖性自发荧光和光毒性。当使用自发氧化可忽略不计的荧光素酶底物时，BLI 可以实现低至零背景，从而实现对深层组织发出的信号进行灵敏的非侵入性检测。直接比较已经验证了生物发光在信号背景比方面优于荧光，用于检测穿过 >1 mm 组织的细胞4。因此，在过去的二十年里，BLI 已成为哺乳动物疾病模型中报告基因表达和跟踪细胞和病毒位置的常规方法3 , 5 .

然而，BLI 在神经科学中的应用仍然不常见。一个主要原因是血脑屏障（BBB）限制了传统荧光素酶底物进入中枢神经系统。对于ATP依赖性昆虫荧光素酶，例如常用的萤火虫荧光素酶(FLuc)，其天然底物D-荧光素因其尺寸小且能够产生一些脑信号而一度被认为具有血脑屏障渗透性6。然而，最近的研究表明，D-荧光素的大脑传递是有限的。腹膜内 (ip) 注射D -荧光素在Bdnf-Luc小鼠的大脑皮层中产生低信号7和D-荧光素是 ATP 结合盒转运蛋白 G2 的有效底物，介导小分子的 BBB 流出8。因此，研究人员开发出了具有更亮的大脑生物发光能力的合成D-荧光素类似物，包括 CycLuc1（参考文献9）和 AkaLumine 10（也称为 TokeOni 7）。特别是，AkaLumine比使用 FLuc 7或 AkaLumine 优化的 AkaLuc 10的D-荧光素从大脑产生更多的光。AkaLuc-AkaLumine 系统可以对自由活动的小鼠和狨猴的大脑生物发光进行视频记录10。

对于不依赖于 ATP 的海洋荧光素酶，例如海肾荧光素酶，其天然底物腔肠素也具有中等的 BBB 渗透性11。最近的海洋荧光素酶工程工作导致了 NanoLuc 及其优化底物腔肠素类似物腔肠素类似物 Furimazine (Fz) 12的开发。具有 Fz 的 NanoLuc 表现出高催化活性，因此在生物医学研究中得到了广泛的应用。对于体内应用，NanoLuc 发出的蓝光通常通过生物发光共振能量转移到融合到 NanoLuc 的荧光蛋白而发生红移，如 Antares 13 、Lumiflors 14和eNLs 15所示。具体来说，Antares 由与两个 CyOFP1 荧光蛋白结构域融合的 NanoLuc 组成，其发射峰位于 589 nm。此外，还开发了具有改进的溶解度和生物利用度的 Fz 类似物氢呋喃嗪 (HFz) 和氟呋喃嗪 (FFz)，以最大限度地提高基于 NanoLuc 的报告基因 16 、17的体内亮度。采用 FFz 的 Antares 特别有效，显示出与采用 AkaLumine 的 AkaLuc 类似的身体成像亮度16、17。一起使用这些正交 BLI 系统可以同时跟踪同一只小鼠的肿瘤大小和嵌合抗原受体 T 细胞的可视化16。然而，虽然基于 NanoLuc 的报告基因已用于脑成像18，NanoLuc 脑 BLI 基质的性能尚未得到系统量化和优化。优_ _ _ _ _。

在这里，我们报告了专门针对脑内应用的 NanoLuc 基质的系统评估和优化。使用大脑中表达 Antares 的转基因小鼠，快速筛选和表征现有的 NanoLuc 底物（Fz、HFz 和 FFz）和新的合理设计的 Fz 结构类似物，从而开发出头孢呋利嗪 (CFz)。具有 CFz 的 Antares 在与重复成像兼容的剂量下与具有 AkaLumine 的 AkaLuc 的亮度相匹配，而适合一次性使用的更高剂量可产生 6.5 倍的亮信号。通过腹腔注射 CFz，我们实现了对自由活动小鼠中表达 Antares 的神经元的生物发光的视频记录。我们还对哺乳动物大脑中基因定义的神经元群的感觉诱发活动进行了非侵入性钙成像演示。

结果

表征现有 NanoLuc 基质的大脑性能

为了便于比较小鼠大脑中的 NanoLuc 底物，我们开发了转基因小鼠，其在特定类型的神经元中表达 Antares 荧光素酶。具体来说，我们将之前报道的在H11安全港基因座16中携带 CAG -loxP- STOP -loxP- Antares (CAG-LSL-Antares) 转基因的小鼠与组织特异性 Cre 重组酶驱动小鼠进行杂交。本研究中使用的驱动线包括Camk2a-cre（前脑兴奋性神经元）21、Vglut2- IRES -cre（兴奋性谷氨酸能神经元）22和Vgat- IRES -cre（抑制性 GABA 能神经元）22。由于报告基因在广泛的人群中稳定表达，小鼠之间的变异性低于病毒转导，并且统计可靠性增加。

我们首先探索了现有 NanoLuc 基板 Fz、HFz 和 FFz 的亮度和信号分布。HFz 和 FFz（图1a）是 Fz 的衍生物，具有改善的水溶性和生物利用度，可为小鼠体内成像产生更明亮的信号16。在 CAG-LSL-Antares 和Vgat- IRES -cre转基因双半合子小鼠中，腹腔注射 Fz 产生来自前脑和后脑的信号（图1b），与 VGAT 的预期表达模式相匹配21 , 22。出乎意料的是，FFz 产生了不同的信号分布，前脑的亮度较低，后脑的信号较高，而大脑外头部区域的信号最高（图 1b ）。我们对由Camk2a-cre驱动的 Antares 小鼠进行成像，Camk2a-cre 在前脑中最活跃，以测试 FFz 分布或报告基因表达是否在确定信号位置中占主导地位。事实上，虽然 Fz 产生了预期的前脑丰富信号，但 FFz 仍然产生主要来自后脑的信号（扩展数据图1a）。作为历史对照，在Camk2a-cre对照下表达的具有 FLuc 的D-荧光素也显示出预期的前脑特异性信号（扩展数据图1b ））。我们还测试了 HFz。HFz 从大脑中产生的信号与 Fz 类似，但信号要暗十倍以上（图1b）。

图 1：新型氟化 Fz 类似物可改善大脑性能。

a，已建立的 NanoLuc 基底的结构。b，双半合子小鼠中Vgat -IRES- cre和 CAG-LSL-Antares 转基因的 NanoLuc 底物之间的比较；顶部，线性伪彩色；底部，原始灰度格式。c – f ， Vgat -IRES- cre和 CAG-LSL-Antares 转基因双半合子小鼠中 Fz 及其氟化类似物之间的比较。在基于PEG-300的溶液中腹膜内施用底物。c，Fz及其氟化类似物的化学结构。d，具有峰值生物发光的代表性图像。e, 大脑中随时间变化的生物发光强度。数据以平均值±sem表示；n  = 每种化合物 4 只动物或 Fz 3 只动物。f ，来自e 的峰值信号强度的统计分析。P值通过单因素方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 事后检验确定。数据表示为平均值±sem

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CFz，一种具有更高大脑亮度的底物

与 Fz 相比，HFz 和 FFz 的大脑性能受损表明羟基和氨基可能不适合大脑应用。为了提高大脑的性能，我们探索去除这些基团并用相同的环（即连接到双环核心的 C6 原子的苯环）仅用氟原子取代。这些衍生物包括2'-氟取代的化合物4、3'-氟取代的化合物5和2',3'-二氟取代的化合物6 (图1c )。正如之前报道的23 ， 4'-氟取代显着降低了光输出，并且没有进一步研究。化合物4 – 6在以泊洛沙姆-407 (P-407) 作为赋形剂的水性制剂中，其溶解度比 Fz 更高，这是一种方便体内研究的制剂24。

我们将 Fz 与小鼠大脑中的这些新氟化类似物4 – 6进行了比较。我们将 1.3 μmol Fz（含有聚乙二醇 300 (PEG-300)，因为 1.3 μmol 不溶于 P-407）或化合物4 – 6（含有 P-407）注入 CAG-LSL-Antares、Vgat- IRES -通过ip途径产生双半合子（图1d）。新基质4 – 6均主要产生皮质信号。虽然单氟化取代基4和5显示出与 Fz 相似的峰值光产生，但双氟化类似物6明显更亮（图 2）。1e,f）。为了确认体内的改善并非特定于表达Vgat的神经元，我们还在表达由Vglut2- IRES -cre或Camk2a-cre驱动的 Antares 的小鼠中比较了6与 Fz 。在这两个模型中，6 的亮度大约是 Fz 的 2.5 倍（扩展数据图2a、b）。然而，对于肝脏中 Antares 的非侵入性检测，6比 FFz 暗三倍（扩展数据图2c）。

我们对6和 Fz进行了体外酶学表征。Antares 的发射光谱相似（图2a）。相对于 Fz，6显示出 1.33 倍高的k cat和类似的K m增加（图2b）。事实上，6比 Fz 改善了 2.5 倍的大脑信号，这与k cat 的改善不成比例，并且尽管K m更高，但仍然如此，这意味着在体内表达荧光素酶的神经元中可以得到更高的游离浓度的6 。

图 2：化合物 6 酶学、PK 测量和配方。

a，使用Fz或化合物6作为底物时Antares的发射光谱。b ，确定Antares与每种底物的相对k cat和绝对K m的动力学参数。数据以平均值 ± 标准差表示；n  = 3 次技术重复。计算标准偏差是为了提供每次测量的技术可靠性的测量，而不是为了统计比较的目的。c ，腹腔注射 1.3 µmol 任一底物后Fz 和化合物6的小鼠血浆水平。数据以平均值 ±  sem表示；n = 5 分钟时每种化合物有 8 只动物， 10 分钟时每种化合物n = 4 只动物。d，每种底物的脑浓度（左）和脑与血浆比率（右）。数据以平均值 ±  sem表示； 每个时间点每种化合物n = 4 只动物。P值通过双尾学生未配对t检验确定。e ， Camk2a-cre和 CAG-LSL-Antares 基因双半合子小鼠中化合物6的剂量和载体优化。显示了峰值生物发光（左）和随时间变化的生物发光强度（中）的代表性图像。数据以平均值 ± 扫描电镜； 每种条件下n = 4 只动物。右侧显示了双尾学生未配对t检验对峰值信号的统计分析； 1.3 至 2.6 µmol 之间，P  = 0.0002，2.6 至 4.2 µmol 之间，P = 0.0174。化合物6以下命名为CFz。

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为了研究6改善大脑性能背后的机制，我们在注射底物后 5 分钟和 10 分钟（即它们的大脑信号在 Antares 中达到峰值的时间点）对野生型小鼠进行了6和 Fz 的血浆和脑药代动力学 (PK) 测量。表达小鼠。血浆浓度表明6在腹膜内注射后生物利用度得到改善（图2c）。然而，两种底物的脑浓度和脑与血浆比率（图2d）与其在脑中的亮度没有很好的相关性，这意味着除了脑组织中的体积浓度之外的其他因素也会影响亮度。具体而言，在 5 分钟、 6 处达到峰值亮度时和 Fz 浓度分别达到 1.4 和 1.1 μM，均高于这些底物 Antares 的K m值。因此，需要更高的有效游离浓度 6 来解释其更大的光输出，这可能是由于神经元（表达 Antares 的细胞类型）的运输得到改善，而这在总脑组织的标准 PK 测量中是不可辨别的。或者，6可能表现出较少的蛋白质或脂质结合，因此尽管总组织浓度相似，但游离浓度较高。由于 PK 测量是在没有 Antares 的野生型小鼠中进行的，因此可以排除底物消耗的影响。

我们进行了额外的结构-活性关系分析，以探讨化合物6之外是否可以进一步改进。在 C8 连接的苄基环上进行4 – 6的氟化，发现可以提高之前的k cat 16，但并没有进一步提高体内大脑亮度（扩展数据图3a）。6在 C2 连接的呋喃环上的甲基化（之前发现与 NanoLuc 催化相容）23产生的化合物10表现出相似的亮度（扩展数据图3b），但溶解度降低（扩展数据图3c））。结合这两种策略产生了化合物11 – 13。其中一种化合物13在大脑中比6亮1.5-2.0 倍（扩展数据图4）。最后，我们测试了6和13对小鼠的毒性。单次腹腔注射用 20 mg P-407 溶解的 4.2 µmol 6，对心脏和肾组织的影响最小，且体重不减轻（补充表 1），比用相同量的 FFz 治疗后观察到的影响更小16 . 相比之下，一次性注射 4.2 µmol 13导致严重的肾脏病理和体重减轻（扩展数据图5）。重要的是，接受任一底物的小鼠均未发现肺或脑损伤的迹象（补充表1）。鉴于其较低的毒性及其在大脑中的特定用途，我们选择了6 种进行进一步使用，并将其命名为 CFz。

优化 CFz 剂量

我们测试了 CFz 配方与纵向成像的兼容性以及最大大脑亮度。每日给予 1.3 µmol CFz（含 12 mg P-407 赋形剂）3 或 5 天后，对器官组织的影响轻微，体重减轻仅限于 <5%（扩展数据图 6 和补充表1 ））。5天后，肝脏和脾脏的巨噬细胞中出现透明的囊泡（补充表1）。由于在施用 PEG 25后观察到类似的效果，这些囊泡可能含有累积的 P-407 聚合物。总而言之，这些结果表明，CFz 可用于剂量为 1.3 µmol 和 12 mg P-407 的纵向成像。

如上所述，单次注射 4.2 µmol CFz 和 20 mg P-407 产生的毒性最小。然而，每天 3 次腹腔注射 4.2 µmol CFz 和 20 mg P-407 对器官有明显毒性（扩展数据图7a和补充表1）。因此，不建议使用该配方重复成像。为了了解毒性来源，我们单独测试了 20 毫克 P-407 载体 3 或 5 天，发现 3 天时对器官产生轻微影响，但 5 天时产生严重影响（扩展数据图 7a 和补充表1 ））。因此，每天服用 3 次 4.2 µmol CFz 和 20 mg P-407 后的毒性可能来自单独的底物或底物与赋形剂的组合。此外，三个剂量的 20 mg P-407 单独诱导巨噬细胞中出现透明囊泡（补充表1），表明这种反应也不需要 CFz。在我们手中，当溶解 4.2 µmol CFz 时，P-407 的量无法降至 20 mg 以下，因为 20 mg P-407 中已经残留有少量 CFz 残留物，但 30 mg 中则没有（扩展数据图 7b ））。

然而，4.2 µmol CFz 与 20 mg P-407 的大脑产生的生物发光比 1.3 µmol 剂量亮 6.5 倍（图 2e和扩展数据图7c）。如果需要在单个时间点最大化灵敏度，则该剂量可能有用。

比较大脑中荧光素酶系统的性能

接下来，我们将来自 Antares-CFz 系统的大脑信号与带有标准D-荧光素底物或更亮的 CycLuc1 的 FLuc 进行比较（参考文献9）。Antares 和 FLuc Cre 依赖性转基因以类似方式重组到H11基因座中，并与Vgat- IRES -cre、Vglut2- IRES -cre或Camk2a-cre驱动程序杂交。根据驱动器的不同，含有 1.3 ΜMOL CFZ 的 ANTARES 产生的亮度比含有 CYCLUC1 的 FLUC 高 5 至 7.5 倍，而后者又比含有D-荧光素的 FLuc 亮 3 至 4 倍（图 3a-d 和扩展）数据图8a、b）。这些系统之间的大脑信号分布看起来相似。

图 3：CFz-Antares 与其他生物发光报告系统的比较。

a – d，转基因小鼠中 Antares-CFz 和其他荧光素酶报告基因之间的比较。a，在 VGAT +神经元中表达的记者的峰值生物发光的代表性图像。b，随时间变化的生物发光强度。数据以平均值±sem表示； 每种情况下n = 3 只独立的动物。c ，CaMKIIα +神经元中表达的记者的峰值生物发光的代表性图像。d，生物发光强度随时间的变化。数据以平均值±sem表示；n = 分别为 7、4、3、4 和 4 只动物，AkaLuc 含 3 µmol AkaLumine，AkaLuc 含 1.3 µmol AkaLumine，Antares 含 1.3 µmol CFz，FLuc 含 0.62 µmol CycLuc 或 FLuc 含 13 µmol d -荧光素。e，与 Antares 和 AkaLuc 编码的 AAV 共同感染的 J:NU 小鼠海马中 Antares-CFz 和 AkaLuc-AkaLumine 的代表性生物发光图像。f，峰值信号强度的比较。数据以平均值±sem表示；n  = 4 只动物，对每只动物进行 Antares-CFz 和 AkaLuc-AkaLumine 信号测量。P值通过双尾学生配对t检验确定。

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为了比较 Antares–CFz 与 AkaLuc–AkaLumine，我们在同一动物中进行了基因匹配表达和共表达的实验。首先，我们创建了将 CAG-LSL-AkaLuc 重组到H11位点的转基因小鼠，以获得与之前创建的 CAG-LSL - Antares 转基因小鼠16相同的控制元件和基因组背景，并与Vgat-cre或Camk2a-cre驱动程序杂交老鼠。在所得的双半合子中，含有 1.3 µmol CFz 的 Antares 在推荐的 3.0 µmol 剂量下产生了与含有 AkaLumine 的 AkaLuc 相当的峰值信号和分布模式（图 3a- d））。AkaLuc-AkaLumine 在 3.0 或 1.3 µmol 剂量下比 Antares-CFz 产生更持续的信号（图3b、d）。接下来，我们通过将等滴度表达 Antares 和 AkaLuc 的腺相关病毒 (AAV) 注射到海马体中，在同一大脑中表达 Antares 和 AkaLuc。三周后，这些小鼠交替接受 CFz、FFz 或 AkaLumine 治疗。CFz 比 FFz 亮至少一个数量级，并且 1.3 µmol CFz 产生的峰值信号与 3.0 µmol AkaLumine 相当（扩展数据图 8c、d）。当 CFz 剂量增加至 3 µmol 时，亮度增加至 3 µmol AkaLumine 的约三倍（图3e、f））。因此，Antares–CFz 的亮度在适合日常成像的 1.3 µmol 剂量下与 AkaLuc–AkaLumine 相匹配，并且在适合偶尔成像的 3 µmol 剂量下超过它。

CFz 清醒小鼠脑部生物发光成像

受到 Antares-CFz 与 AkaLuc-AkaLumine 相当性能的鼓舞，我们尝试对自由活动的小鼠大脑中的 Antares 信号进行视频速率非侵入性成像。先前已在静脉内 (iv) AkaLumine 给药后证明了运动小鼠大脑中 AkaLuc 信号的视频速率跟踪10。我们发现，在更容易地腹腔注射 1.3 µmol CFz 后，在自由移动的小鼠中，暴露时间为 60 毫秒的Camk2a-cre驱动的 Antares 清晰可见（图4a和补充视频1），从而能够同时可视化小鼠运动和大脑生物发光。

图 4：CFz 的体内应用。

a ， Camk2a - cre和 CAG-LSL-Antares 转基因双半合子小鼠的视频速率成像。腹膜内注射 CFz 后，使用 EM-CCD 相机监测自由移动的小鼠。交替采集明场图像和发光图像（每个图像曝光时间为 60 毫秒），并显示代表性帧。显示了持续 3 分钟的集成发光图像。b，采用足部振动刺激的头部固定清醒小鼠的生物发光脑成像方案。c – e ， Vgat - cre驱动基因和 CAG-LSL-Antares 转基因双半合子小鼠之间刺激依赖性脑生物发光反应的比较（Vgat-Antares) 或 CAG-LSL-CaMBI110 转基因 ( Vgat -CaMBI110)。c ，从Vgat -Antares（顶部）或Vgat -CaMBI110（底部）转基因小鼠中重复的20秒BLI周期平均和归一化的图像序列的代表性帧。对于每组图像，显示伪彩色图像（顶部）和灰度图像（底部）。d ， c中延时、平均和标准化皮质生物发光的定量。每条线代表n = 3 只动物的平均值 ；每条线周围的阴影区域代表 sem 灰色框表示施加到小鼠后爪的振动刺激的时间。痕迹是 20 个刺激周期的平均值。e, d中每只小鼠2-s时间点前后的曲线下面积（AUC）值的比较。数据以平均值±sem 表示。P值通过双尾学生未配对t检验确定。

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由于大脑中的血流是由神经元活动诱导的，并且荧光素酶反应所需的底物和氧气是通过血液输送的，因此 Antares-CFz 和 AkaLuc-AkaLumine 信号可能本质上受到活动的影响。为了测试这一点，我们以 1 秒振动的形式对一只脚施加感官刺激，同时以每秒 5 帧的速度记录 Antares 或 AkaLuc（图 4b ）。对小鼠进行头部固定以减少运动或定向伪影，并通过眼眶后 (ro) 施用 CFz，因为头部固定后无法接近腹侧区域。在Camk2a-cre控制下前脑表达 Antares 的小鼠中，刺激后双侧生物发光增加，2 至 4 秒后达到峰值（扩展数据图9a、b））。双侧模式可能表明唤醒反应引起广泛的神经元激活，正如之前在功能磁共振成像 (fMRI) 中观察到的那样26 , 27。在Vgat-IRES-cre控制下表达 Antares 的小鼠中也观察到类似的反应（图4c、d和补充视频2）。这些变化的方向（增加）和持续时间（4 秒）在小鼠之间是一致的，这表明它们可能是血流变化的可靠指示，类似于功能磁共振成像28。

刺激诱导的信号变化也发生在Camk2a-cre驱动的 AkaLuc 小鼠中（扩展数据图9c）。然而，它们的方向（向上和向下）和持续时间（4 至 13 秒）在小鼠之间差异很大，使得解释变得更加困难。一种可能性是，AkaLumine 最初分布到组织隔室，然后其释放可能会受到身体运动的影响。然而，总的来说，这些结果表明来自 Antares-CFz 和 AkaLuc-AkaLumine 系统的生物发光信号都受到感觉刺激的影响，可能是通过血流动力学效应。

使用 CaMBI 和 CFz 进行脑部无创钙成像

由于先前的研究表明神经元钙流入先于小鼠皮层的血流动力学变化29 , 30 , 31，我们接下来测试基于 NanoLuc 的钙报告基因是否可以提供更快的非侵入性大脑活动指示。已经开发了几种基于 NanoLuc 的钙指示剂，包括 GeNL(Ca 2+ ) 15、 CalFluxVTN 32、 GLICO 33、 LUCI-GECO1 （参考文献34）、 CalBiT 20、用化学染料 MaPCa 35标记的 H-Luc和 Orange CaMBI 36。Orange CaMBI110 由 Antares 组成，其钙传感模块插入 NanoLuc 结构域，对钙的响应性高出八倍，解离常数为 110 nM。由于我们已经培育出以 Cre 依赖性方式表达 Orange CaMBI110 的转基因小鼠16，因此我们用它们来测试 CFz 是否能够对大脑中基因定义的神经元进行非侵入性钙成像。

我们对Vgat- IRES -cre和 CAG-LSL - CaMBI110 转基因半合子小鼠进行了感觉刺激和 BLI 36。事实上，除了之前观察到的刺激后 2-6 秒发生的血流动力学反应外，我们还观察到刺激后 1 秒出现较早的生物发光峰（图4c、d和补充视频3）。定量证实CaMBI110和Antares小鼠表现出相似的晚期反应（刺激后2-6秒），但只有CaMBI110小鼠表现出显着的早期反应（0-2秒；图4e ））。因此，仅由 CaMBI110 揭示的早期生物发光反应可能代表钙流入，而 CaMBI110 和 Antares 共有的晚期反应可能是由于底物或氧气供应的血流动力学变化。总而言之，这些结果表明 CFz 和 CaMBI110 能够实现神经元钙活性的非侵入性检测。

出乎意料的是，我们归因于神经元活动的早期 CaMBI110 特异性反应也表现出双边模式，而对刺激的直接皮质反应可能会在刺激对侧的半球中更强。一种解释是，大部分神经元激活来自全皮层唤醒反应的二级激活，主导任何单侧初级反应。为了测试这一点，我们对处于麻醉状态的相同报告小鼠进行刺激和 BLI（扩展数据图10）。与清醒状态下观察到的生物发光反应幅度相比，生物发光反应的幅度大幅下降，这与清醒小鼠的生物发光反应主要反映唤醒反应的假设一致。

讨论

在这项研究中，我们开发了一种新的底物 CFz，与以前标准剂量下的最佳底物相比，它可以将基于 NanoLuc 的报告基因在大脑中的 BLI 敏感性提高至少 2.5 倍，同时将 BLI 的灵敏度进一步提高 6.5 倍。偶尔提高剂量即可达到亮度。Antares 荧光素酶与 CFz 的组合在大脑中实现了与 AkaLuc-AkaLumine 相当的亮度，AkaLuc-AkaLumine 是以前用于大脑成像的最亮的 BLI 系统。通过腹腔注射 CFz，我们展示了以视频速率非侵入性地可视化大脑中表达 Antares 的细胞的能力。我们还使用 CFz 与钙调节生物发光指示剂 CaMBI110 对小鼠大脑中感觉诱发的神经元活动进行基因指定的非侵入性成像。

重要的是，由于 CFz 是 NanoLuc 的优异底物，因此它可以立即以即插即用的方式应用于现有的基于 NanoLuc 的报告基因，例如报告基因编码的 AAV 载体、报告细胞系和转基因动物。也就是说，这些报告基因现在可以在大脑中使用，其灵敏度比以前的 NanoLuc 底物高几倍。

为了促进小鼠大脑中荧光素酶底物的快速评估和表征，我们在本研究中使用转基因小鼠作为筛选平台。转基因报告小鼠品系为底物筛选提供了主要优势。首先，一旦转基因小鼠系成功建立，它们就会成为稳定的供应，而无需额外的手术或其他昂贵且耗时的程序。其次，报告基因的稳定表达可以减少变异的来源，例如报告基因表达水平的日常变化或操作过程中引入的技术变化，从而增加统计相关性并减少所需的小鼠数量。最重要的是，转基因小鼠具有完整的血脑屏障，而其他涉及手术的模型可能会破坏血脑屏障的完整性，

我们专注于可以通过腹腔注射递送的底物，与静脉内或RO注射相比，腹腔注射更容易执行，并且比皮下注射产生更明亮的生物发光。通常，静脉注射会产生更高的生物发光峰值，但也会导致更快的衰减37。在头部固定小鼠脑成像实验中，由于头部固定后小鼠腹部难以接近，采用ro作为给药途径，观察到与静脉注射类似的信号特征（扩展数据图9a ）。直接、系统地比较这些不同给药途径之间 CFz 的脑内表现将是很有意义的。

记住底物在活体动物中的作用类似于药物38是有用的。除了体外表征之外，还应全面评估底物和制剂的药效学和毒性。在这里，对候选底物 CFz 和化合物13进行体内毒性检查，选择 CFz 是因为单次 4.2 µmol 剂量后毒性较小（补充表1）。对于连续 BLI，每天腹腔注射 1.3 µmol CFz，持续长达 5 天，似乎具有良好的耐受性。相比之下，连续 7 天每天静脉注射 60 µg（0.16 µmol）Fz 会导致肝和肺损伤39，而每天 20 µg 静脉注射显示出最小的毒性。每天 5 次服用 20 mg 的 P-407 赋形剂单独会引起显着的毒性，因此其他赋形剂的未来鉴定可以使高剂量 CFz 重复 BLI 成为可能。关于其他荧光素，虽然 AkaLumine 已开发出来并表现出优越的体内性能10、40 ，但后续研究显示 Akalumine 溶液对皮肤和心脏具有明显的毒性，这可能是由于所施用溶液的酸性所致41、42。最后，关于D-荧光素体内毒性的系统研究报道很少，推测高浓度使用也可能有毒43 , 44。

选择荧光素酶底物系统时还应考虑大脑中光产生的动力学。Antares-CFz 大脑信号比 AkaLuc-AkaLumine 信号上升和衰减更快。AkaLuc–AkaLumine 信号较慢可能是由于 AkaLumine 渗透到大脑较慢，因为体内的 AkaLuc–AkaLumine 信号较快16。缓慢的信号衰减可能有利于延时成像。然而，对于跟踪脑刺激的血流动力学反应的特定任务，AkaLuc-AkaLumine 对刺激的反应变化很大（扩展数据图9b、c）），这表明 AkaLumine 在某些小鼠大脑中的渗透可能太慢，无法报告以秒为单位的时间尺度上发生的血流动力学反应。相比之下，Antares-CFz 可靠地报告了刺激引起的反应。此外，CFz 更快的动力学对于多重 BLI 是有利的，因为 CFz 的快速衰减允许使用第二个 BLI 系统，例如 AkaLuc-AkaLumine，而无需长时间延迟。

在我们的研究中，大脑外部最亮的底物 FFz 并不是大脑神经元中最亮的底物。此外，CFz 的生化测量和 Fz PK 测量显示脑组织中的浓度相似，尽管 CFz 的亮度要高几倍。因此，大脑外部的表现和大脑中的 PK 测量都无法预测 CFz 的更好表现。这些结果证明了凭经验测试荧光素酶底物对大脑亮度的重要性，并表明其他化合物（例如药物）也可能证明脑组织中的可测量浓度与其目标酶活性（药效学）之间缺乏相关性。

在这项研究中，Antares 和 AkaLuc 信号揭示了头部固定的清醒小鼠的感觉刺激与生物发光强度变化之间的相关性（图 4b -d和扩展数据图9b、c）。我们假设血流动力学变化可能是这些反应的基础，因为荧光素酶依赖血液循环来提供所需的底物和氧气，并且含氧血液的流动是由大脑中的神经元活动引起的28。这一假设得到了观察的支持，即相关性既不是特定于驱动程序也不是特定于报告者。特别是，皮质 AkaLuc BLI 还揭示了刺激依赖性信号波动（扩展数据图9c ）)，尽管 AkaLuc 属于与 Antares 不同类别的荧光素酶，并且依赖于 ATP 1 , 2。因此，研究人员在以频繁（<10 秒）间隔执行延时 BLI 时应谨慎对待血流动力学反应可能产生的干扰。然而，组成型荧光素酶的 BLI 可以发展成为研究体内血流动力学的替代方法，产生与功能磁共振成像类似的信息，但不需要昂贵的机器。然而，血流动力学的 BLI 调节可能依赖于大脑区域，因为在足部电击刺激的基底外侧杏仁核中没有观察到这种情况45。

最后，我们使用钙调节生物发光指示剂 Orange CaMBI110 的结果显示，在血流动力学反应之前存在积极的感觉诱导反应（图4c-e和补充视频3）。这与神经元激活和随后的血流动力学反应之间已建立的关系一致29 , 30 , 31。此外，假定的钙和血流动力学信号幅度的相似性 (~10%) 表明，任何进一步的 CaMBI 改进都可能产生高于血流动力学响应的钙特异性信号。改进的 CaMBI 还将提高检测高度局部神经元活动的机会。最近一项对轻度麻醉 Thy1-GCaMP6f 小鼠的研究表明，振动刺激引起的局部神经元反应幅度较低（对侧：1.6% Δ F / F；同侧：0.8% Δ F / F）46。因此，提高CaMBI型报告基因的响应以匹配或超越荧光钙指示剂是生物发光活性成像的一个重要方向。

总之，CFz 的开发应该能够在临床前动物模型的大脑中实现基于 NanoLuc 的敏感生物发光成像。Antares 与 CFz 和 AkaLuc 与 AkaLumine 的理想生物发光特征以及这两种生物发光报告系统之间的高度正交性为大脑双重成像的未来应用提供了几种有吸引力的途径。例如，二群体脑成像可用于研究免疫细胞和癌细胞之间或病毒和免疫细胞之间的相互作用。另一种可能性是使用这些正交荧光素酶作为同一细胞中不同生化途径的转录报告基因，或作为大脑中不同细胞类型中相同途径的报告基因。

方法

化合物表征

所有新化合物均采用方案1（补充说明）16、47中描述的合成路线制备。Fz、HFz 和 FFz 之前已报道过12、16。新合成化合物的表征（1 H-NMR、13 C-NMR 和 MS）可在补充信息中找到。

用于整体动物成像的固体制剂

使用以下方案制备固体配制的Fz类似物的储备样品。首先，将 P-407 (Pluronic F127) 放入螺口玻璃瓶中。然后将聚合物在水浴中加热至75°C直至熔化。将溶解在乙醇中的Fz类似物添加到热聚合物中，用薄抹刀充分混合。将 Fz 类似物在乙醇中的额外漂洗液添加到热聚合物中以进行定量转移。然后真空除去溶剂。该浓缩样品用水稀释，制成 4-9 mM Fz 类似物在水中的分配混合物。接下来，将该水性原液等分到玻璃瓶中，冷冻并冻干过夜，得到黄色饼。对于腹腔注射到小鼠中，将 DPBS（康宁，21-031-CV）添加到小瓶中并摇动以产生澄清溶液。

用于底物比较的转基因小鼠生物发光成像

动物程序是按照美国农业部和 NIH 道德法规进行的，并得到了斯坦福大学机构动物护理和使用委员会的批准。将小鼠饲养在湿度为 45-65%、温度为 20-24°C 的环境中，并进行 12 小时光照/12 小时黑暗循环。

在H11位点 ( H11P ) 插入 LSL-CAG-荧光素酶（Antares、FLuc 或 AkaLuc）的转基因报告小鼠是由斯坦福转基因、敲除和肿瘤模型中心通过48 号囊胚中的 φC31 介导的重组产生的。对于底物比较，2 至 4 个月大的转基因小鼠具有Camk2a-cre（杰克逊实验室，005359）、Vgat- IRES -cre（杰克逊实验室）、Vglut2- IRES -cre（杰克逊实验室，016963）或Alb-cre（杰克逊实验室，003574）驱动程序和 CAG-LSL - Antares、CAG-LSL - AkaLuc 或 CAG-LSL -FLuc记者通过吸入异氟醚麻醉5分钟。使用电动剃须刀去除Camk2a-cre、Vglut2- IRES -cre或Vgat- IRES -cre小鼠的头皮毛发或Alb-cre小鼠的腹毛。然后将奈尔脱毛膏（Church and Dwight）涂抹在剃毛区域1分钟，并用一块无菌纱布去除剩余的毛发。然后用 DPBS 冲洗该区域，并用一块无菌纱布用 70% 乙醇清洁。

对于表达 Antares 的小鼠，将指定量的 Fz 溶解在 480 µl 基于 PEG-300 的制剂中，该制剂由 10% 甘油、10% 乙醇、10% 羟丙基环糊精和 35% PEG-300 水溶液组成，或指定量的冻干 Fz将具有 P-407 载体的类似物在 150–500 µl DPBS 缓冲液中重新溶解。对于表达 FLuc 的小鼠，指定的D量-荧光素溶解在PBS中。对于表达 AkaLuc 的小鼠，将 3 μmol (1.0 mg) AkaLumine-HCl (Sigma-Aldrich) 溶解在 150 μl 0.9% NaCl 中。然后将底物注入左下腹腹膜腔，最大注射体积为 480 µl。底物注射后，立即在运行 Aura 软件版本 3.1 或 4.0（光谱仪器成像）的 Ami HT 生物发光成像系统中以 1 分钟的间隔采集生物发光图像 15-30 分钟。为了比较 1.3 µmol 的底物，使用了以下成像仪设置：发射滤光片打开、视场为 25 cm、光圈值为 1.2、分档为 2 × 2、曝光时间为 2 秒。为了与 >1.3 µmol 底物进行比较，使用了以下设置：发射滤光片打开，视场为 25 cm，光圈值为 1.2，1 × 1 的分箱和 1 s 的曝光时间。伪彩色图像和强度比例尺是用 Aura 软件生成的。使用斐济版 ImageJ 程序 (NIH) 对集成发光进行量化49，并在 GraphPad Prism（版本 9.0.0）中进行进一步的统计分析。

Antares 和 Fz 类似物的酶分析

将克隆 ATG-3802（针对大肠杆菌优化的 Antares 密码子）的单菌落接种到2 毫升含有 100 µg ml –1氨苄青霉素的 LB 肉汤中，并在 37 °C 下生长过夜。第二天，将过夜培养物按 1:100 稀释到含有 50 ml Terrific Broth 和 100 µg ml –1氨苄青霉素的烧瓶中。样品在 37°C 下摇动 (275 rpm) 培养 4 小时。将培养物在冰上冷冻，并添加1%鼠李糖以诱导蛋白质表达。将培养物置于 15°C 摇床（275 rpm）中并生长 48 小时。通过离心收集细胞并重悬于 10 ml 100 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、10 mM 咪唑和 1 mg ml –1溶菌酶。将重悬的细胞在冰上进行超声处理（开启 5 秒，关闭 5 秒，持续 2 分钟，12 振幅）。将样品离心（12,000 g，15 分钟），并将 1 ml HisLink 树脂 (Promega) 添加到澄清的裂解液中。样品在轨道混合器上于 4°C 下孵育 2 小时。孵育后，用HisLink洗涤缓冲液(Promega)洗涤树脂3次。最后一次洗涤后，用 1 ml HisLink 洗脱缓冲液 (Promega) 将样品洗脱（混合孵育 3 分钟）两次。将样品在 TBS 和 50% 甘油中透析（10-kDa 截留分子量，Thermo Fisher Slide-A-Lyzer）24 小时。

为了测量 Fz 和新底物的发射光谱，将 50 μl 100 pM Antares 蛋白和 0.01% (wt/vol) 牛血清白蛋白 (BSA; Promega) 的 DPBS (Life Technologies, 14190) 溶液与 50 μl 30 μM 底物和 0.01% BSA 的 DPBS 溶液一式三份。然后使用 Infinite M-1000 光度计 (TECAN) 测量 400 至 750 nm 的发射。

为了将发光定量为底物浓度的函数，将底物稀释至 30 μM，并以两倍的步骤连续稀释到含有 0.01% BSA 的 DPBS 中，一式三份。然后将 50 微升每种底物稀释液与 50 μl 20 pM Antares 蛋白在含有 0.01% BSA 的 DPBS 中的溶液混合。立即使用 GloMax-Multi+ 发光计 (Promega) 测量发光。然后使用 Prism (GraphPad) 程序中的 Michaelis-Menten 非线性回归函数计算K m和V max 。

体内底物药代动力学

上海睿智在 6 至 8 周龄禁食过夜的雄性 C57BL/6 小鼠中对 Fz 和化合物6进行了 PK 测量。将Fz 和化合物6配制成含 10% 乙醇、10% 甘油、10% 羟丙基-β-环糊精 (Sigma-Aldrich)、35% PEG-300 和 35% 水的澄清溶液。新鲜制备的注射剂量（腹膜内注射，Fz 为 20 mg/kg 体重，化合物6为 21.6 mg/kg 体重）以 20 ml kg –1给药。两个测量系列中的每一个均由四只小鼠和两个时间点组成（系列1，给药前和0.083小时；系列2，0.083小时和0.167小时）。

在每个时间点，通过面静脉放血将约 90 µl 血液收集到 K 2 EDTA 管中。将血浆样品置于冰上并离心，在采集后15分钟内获得血浆样品（ 2,000g ，4℃，5分钟）。血浆样本在分析前储存于 –70 °C。为了进行分析，将 20 µl 血浆样品添加到 20 µl 稳定剂中（200 mg ml –1 EDTA 和 100 mM L-抗坏血酸在水中的 80:20（体积：体积）混合物）。

在每个系列的终点，在动物的头皮上做一个中线切口，并将皮肤牵开。覆盖大脑的头骨被移除。收集全脑，用冷盐水冲洗，在滤纸上干燥，称重并放入干冰中速冻。研究期间未观察到异常症状。每克组织用 4 ml 稳定剂（200 mg ml -1 EDTA 和 100 mM L-抗坏血酸在水中的 80:20（体积：体积）混合物）对脑样本进行均质化。将上述样品（血浆或脑）与 120 µl 内标（格列吡嗪，100 ng ml –1）的乙腈溶液混合。将混合物摇动 10 分钟并以 5,200 g离心4°C 下 10 分钟。将 20 微升上清液转移至新板中，然后添加 20 µl 水。使用 LC-MS/MS 检测对化合物浓度进行定量。

生物分析在配备 AB SCIEX Triple Quad 6500 +质谱仪的 Shimadzu UPLC LC-30AD 系统上进行。质量参数在 MRM 模式下使用 ESI 源电离以正模式进行。使用 Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 × 50 mm，1.7 µm）实现测试样品的分离，流速为 0.60 ml min –1 ，温度为 50 °C。流动相 A 为 0.025% 甲酸和 1 mM 乙酸铵水溶液，B 相为 0.025% 甲酸和 1 mM 乙酸铵甲醇溶液。进样体积为0.5 µl。

PK参数由非房室分析工具Pharsight Phoenix WinNonlin 8.2软件的非房室模型确定。为了计算T half，由“最佳拟合”模型自动选择时间点作为第一选项来估计终末半衰期。当“最佳拟合”无法很好地定义终末期时，应用手动选择。当T max后检测的时间点数量小于3时，不计算终末半衰期和血药浓度-时间曲线下从零到无穷大的面积。

尸检和组织病理学

通过CO 2窒息和心脏放血杀死2月龄的雄性C57BL/6小鼠。对所有小鼠进行称重，并对外部和内部器官进行完整的肉眼检查。收集以下组织并在 10% 中性缓冲福尔马林中浸泡固定 72 小时：肝脏、肾脏和肺。福尔马林固定的组织进行常规处理，包埋在石蜡中，切成5μm的切片并用苏木精和伊红染色。所有载玻片均由委员会认证的兽医病理学家对组织学治疗相关效应进行盲法评估（补充表1 ）。

荧光素酶转导小鼠大脑中生物发光的比较

对于 AAV 包装，pAAV-CMV-AkaLuc-P2A-mNeonGreen-WPRE 质粒和 pAAV-CMV-Antares-P2A-mNeonGreen-WPRE 通过 PureLink Expi 无内毒素 maxi 质粒纯化试剂盒（Invitrogen）进行扩增和纯化，并送往斯坦福基因载体和病毒核心，用于生产 AAV.DJ 载体并测定滴度。在无菌条件下，将 12 周大的雄性 J:NU 小鼠（杰克逊实验室，007850）用异氟烷麻醉并固定在立体定位框架（RWD Life Science）中，并在头骨上钻一个针头大小的孔。将带有 33 号针头的汉密尔顿注射器插入前后 -2.2 mm、中外侧 +1.7 mm 和背腹 -1.7 mm。等待 2 分钟后，将针头拉回 0.3 mm，并加入 1 µl 含 1.4 × 10 10使用注射泵 (KD Scientific)以 0.1 µl min –1的速度注射表达 AkaLuc 和 Antares 的 AAV 的基因组拷贝。每次注射后将针留在原处 3 分钟，以尽量减少病毒溶液的向上流动。AAV 感染后 2 至 3 周，给小鼠腹腔注射指定量的 CFz、Akalumine 或 FFz，并在 Ami HT 上成像（分箱为 1 × 1，曝光时间为 10 秒）。

视频速率小鼠大脑生物发光成像

Camk2a-cre和 LSL-CAG-Antares 双半合子转基因小鼠（雄性，16 周龄），剃去头皮毛发，在腹腔注射 480 µl DPBS 中的 4.2 µmol CFz 和 20 mg P-407 后进行成像。使用配备 iXon ultra 888 电子倍增 CCD (EM-CCD) 相机 (Andor) 和 50 毫米焦距、67 毫米直径和 f/0.95 光圈镜头 (Speedmaster) 的自制成像黑匣子进行生物发光成像。成像过程中，小鼠可以在封闭区域（14.5 × 14.5 cm）内自由移动。使用 Andor Solis 软件中的以下相机设置交替获取生物发光图像和明场图像：曝光时间为 60 ms，分箱为 2 × 2，垂直时钟电压幅度为 4。

清醒小鼠大脑血流动力学和钙动力学的生物发光成像

Camk2a-cre或Vgat- IRES -cre和 LSL-CAG双半合子转基因小鼠- Antares 或 LSL-CAG -将CaMBI110或LSL-CAG-AkaLuc（男女混合，7-12周龄）剃去头皮毛发并固定在SG-4N头架（Narishige International）上，然后注射0.33（用于Antares）或1.3 µmol（对于 CaMBI110）CFz 与 12:1（重量/重量）P-407 溶于 180 µl DPBS 中，或建议量的 AkaLumine 溶于盐水中。一分钟后，使用配备 iXon Ultra 888 EM-CCD 相机（Andor）和镜头（Speedmaster 50-mm f/0.95，67-mm 直径，Zhongyi）的自制成像黑匣子进行生物发光成像。使用 Andor Solis 软件使用以下相机设置进行图像采集：曝光时间为 200 ms，帧速率为 5 Hz，分箱为 4 × 4。开始图像采集一分钟后，使用由 AFG 31000 任意函数发生器 (Tektronix) 门控的 DZS 电动微型振动电机对左后肢施加 57 个机械足部振动刺激周期（1 秒开启和 19 秒关闭）。函数发生器和 EM-CCD 使用由 MATLAB 控制的 NI USB-6221 多功能 I/O 设备（National Instruments）进行同步。

使用 MATLAB 分析图像序列。具体来说，首先减去图像序列的每一帧的暗基线，并根据每个像素的强度生成突出显示具有强生物发光强度的小鼠头部的二元掩模。二进制掩码内部的像素值保持不变，而外部像素的值设置为 NaN。为了考虑基质注射后生物发光强度的衰减性质，计算图像序列的每一帧的二元掩模内的平均像素强度，并使用巴特沃斯低通滤波器对获得的平均强度动态进行平滑。然后将图像序列的每一帧除以平滑平均强度动态的相应值以进行基线校正。之后，图像序列被分成试验，从足部振动刺激前 2 秒开始，持续 20 秒（周期长度）。然后将每次试验的图像序列中的像素值标准化为试验第一秒内的平均值，然后对所有 57 次试验进行平均（在扩展数据图 1 的早期实验中）。9）或前 20 次试验（在所有其他实验中）。对于图像伪彩色，斐济应用查找表来表示–0.3和0.3的ΔL / L 0值，并且伪彩色图像的强度由每帧的归一化发光强度调制。

统计数据

根据初步实验中测量的标准偏差值，使用 G*Power 软件进行的功效计算显示，在三只动物中检测到相对于较低值测量的大脑信号 50% 差异的可能性为 80%。因此，我们的目标是每种条件三只动物，但如果可以通过繁殖获得更多动物，它们也包括在内。数据的正态性通过 Prism 版本 9.0.0 (GraphPad) 中的 Shapiro–Wilk 检验进行评估。学生t检验和单向方差分析 (ANOVA) 与 Tukey 事后检验也在 Prism 中进行。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参阅本文链接的《自然投资组合报告摘要》 。

数据可用性

支持本研究结果的主要数据可在文章及其补充信息中找到。本研究中生成的原始数据可根据要求向通讯作者提供。