蛋白质相互作用（二）--分子生物学

二、分子生物学方法

1. 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。

2. 酵母双杂交

1989年Field等发明了酵母双杂交系统。该系统利用了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域， DNA 结合域（DNA binding domain， BD）及转录激活域（DNA activating domain，AD），将已知基因（诱饵基因）和靶基因或含有靶基因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上，当这两种质粒共同转化酵母感受态细胞，若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如His及LacZ等基因的表达，从而在特定的缺陷培养基上生长。

因此，利用酵母双杂交系统能够筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，还可以研究已知蛋白间的相互作用。利用酵母双杂交技术筛选cDNA文库分离与诱饵蛋白相互作用的蛋白或研究蛋白间的相互作用，一般首先考虑的问题是诱饵载体的构建。编码诱饵蛋白的基因经酶切处理后，按照正确的读码框与诱饵载体如pGBTK7相连接，再经酶切或测序做进一步的验证分析。

    构建好诱饵载体还要同时转化诱饵蛋白酵母菌株如Y187和靶蛋白酵母菌株如AH109，进行毒性和自激活性检测，证明诱饵蛋白的表达对酵母正常生长没有毒性，同时也不能自身激活酵母报告基因的表达，可用于筛选文库或研究蛋白间的相互作用。第二个要考虑的问题就是靶蛋白载体或酵母双杂cDNA文库的构建。

    一般在编码靶蛋白的基因或cDNA两端加上同源重组序列，然后与靶蛋白载体如pGADT72Rec共同转化靶蛋白酵母菌株如AH109，在酵母同源重组酶的作用下，靶蛋白基因或cDNA序列整合到载体上，完成靶蛋白载体或cDNA文库的构建。最后一步就是筛选文库或直接研究两个蛋白间的相互作用。

   分别含有诱饵蛋白载体和靶蛋白载体的酵母杂交后，在酵母体内融合表达BD诱饵和AD靶蛋白。诱饵蛋白和靶蛋白的相互作用，导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如His及LacZ等基因的表达，根据报告基因的表达情况，从而达到分离蛋白或研究蛋白互作的目的。

三、遗传学技术

合成致死筛选

合成致死效应是指两个基因同时发生突变时会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时，则无致死效应。这总遗传学方法可以用于分析两个育幼相同重要功能的蛋白之间的相互作用。由于合成致死突变株是不能存活的，不能直接得到致死菌株，因此，在实验室中多使用条件突变菌株。如温度敏感菌株是可以在某些温度条件下致死的突变型。合成致死筛选所得到的两种相互作用蛋白可能是同一复合物的两种组分或是一种蛋白对另一种蛋白所有的调节作用。

四、展望

蛋白质组学的发展促进了多种研究技术的开发和完善，越来越多的技术趋向于大规模、高通量方向发展。同时，物理学、化学、信息学等基础学科研究的发展也大大促进了这些技术的改进。

    新近发展的计算机分析方法，以基因序列和基因组信息为基础预测蛋白质相互作用，并涉及对参与蛋白质相互作用的表面残基的预测。

    依赖基因序列来分析蛋白质相互作用的分析方法正在形成。而这些先进的、简易的、大规模分析蛋白质相互作用的技术发展又推动了蛋白质组学的进步。可以预见在不久的将来，随着基因组研究和蛋白质组学的不断深入，生命科学中的种种疑难将被逐一攻破。

（遗传学技术在前面一期有详细介绍过喔，想要了解的话可以往前翻阅喔）