 在与癌症交手的3000多年时间里，人类第一次有可能彻底消除一种癌症。 2006年，首个HPV疫苗问世。十余年后，成果可谓显著。在美国，20-24岁女性的宫颈癌发病率逐年下降，2005-2012年间的降幅为33%，而2012-2019年间的降幅高达65%。 2016年，HPV疫苗在中国境内首次获批。截至目前，中国已有5款HPV疫苗产品获批注册，包含3款进口HPV疫苗和2款国产HPV疫苗。在HPV疫苗进入中国的近7年时间里，中国公众对HPV和宫颈癌的知晓程度如何，又有多少人采取了有效的预防措施？根据中国免疫规划信息管理系统的数据，2018-2020年中国9-45岁适龄女性累计接种HPV疫苗剂次为2159.74万剂次，累计估算接种率为2.24%。 人类乳头瘤病毒（HPV）是一种DNA病毒（环状双链），包括200多个亚型，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。按照病毒基因组结构可分为E区、L区、LCR区。其中E6和E7现已被公认为与宫颈癌关联最紧密的致癌基因, 晚期基因则编码两种参与病毒衣壳形成的结构蛋白,并在病毒的感染中发挥重要作用。LCR中则包含多种调控位点，通过与许多细胞和病毒因子的相互作用调节HPV基因转录。
图1 HPV 三维结构 高危型HPV持续感染易引发癌变。HPV主要通过性行为或密切接触传播。根据致癌潜力，HPV分为低危型和高危型，其中高危型包括15个类型，绝大多数HPV感染为无症状的一过性感染，组织学上表现为轻度子宫颈癌上皮内瘤变（CNI1），超过80%的感染可在6-24月内清除。如果持续感染，则进展为CNI2/CIN3，通常HPV持续感染10-20年会进展为癌。研究发现几乎100%的子宫颈癌、88%的肛门癌、65%~70%的阴道癌、50%的阴茎癌、40%以上的外阴癌等肿瘤均与高危型HPV持续感染有关。
图2 由不同亚型HPV诱发的宫颈癌比例 表1 不同亚型HPV相关疾病
HPV病毒颗粒呈球形，其二十面体对称，直径约45~55nm，分子长度约7.8~8kb。HPV的基因组有三个功能区，即早期区(early region,E)﹑晚期区(late region,L)和长控制区(long control region,LCR)。 早期转录区由4500bp组成，编码E1、E2、E4、E5、E6、E7六个早期蛋白，是维持病毒复制，维持细胞内高拷贝数的基因，而E6、E7已经被证实为致癌蛋白。E6和E7蛋白是高危型HPV的主要致癌蛋白，E6 蛋白通过结合并降解P53蛋白，破坏正常的细胞周期调控，促使细胞永生化；E7蛋白则通过结合并降解P53蛋白而使其丧失抑癌功能。 E6和E7蛋白在正常组织中不表达，只表达于HPV感染组织中，因此E6和E7蛋白是制备宫颈癌治疗性疫苗的理想靶抗原。 晚期区编码L1、L2衣壳蛋白，主要参与病毒的组装和DNA包装。作为已经被证实的癌蛋白，E6,E7的特异性使得其成为制作疫苗和控制感染的最佳靶蛋白。
HPV病毒可通过表皮的微小创伤，感染具有増殖能力的黏膜上皮细胞。从感染过程来看，HPV感染的速度与其他病毒相比是非常缓慢的，从其吸附细胞开始到完全入侵宿主细胞这个过程需要较长时间。具体来看，HPV病毒吸附并进入细胞的过程有多种受体的参与，同时伴随着病毒衣壳蛋白L1构象的变化以及L2的剪切。当HPV病毒吸附宿主细胞时，普遍认为，HPV病毒颗粒的主要衣壳蛋白L1会首先与细胞外基质或细胞膜上的硫酸乙酰肝素（HSPG）相互作用，硫酸乙酰肝素在动物细胞组织中广泛存在并且参与到了多种病毒的感染过程中。然后，硫酸乙酰肝素与L1蛋白的结合会诱导L1发生空间构象变化，在此过程中，次要衣壳蛋白L2的N端开始暴露，并且在分子伴侣亲环素B及弗林酶的作用下L2的N端部分片段被剪切，该酶切过程对于病毒进入细胞后病毒基因组的正确释放具有关键作用。接着，HPV在经过衣壳蛋白一系列的构象变化后会与细胞第二受体（非HSPG受体）相互作用，由细胞膜上的网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞作用入胞。目前，关于HPV感染第二受体的研究还没有形成体系，具体地功能蛋白也还不清晰，己有的研究认为该受体可能是整合素、四跨膜蛋白、生长因子受体和整联蛋白A2其中的一种或几种。 病毒入胞后，胞内小体在细胞内随着pH的变化会逐渐诱导HPV衣壳蛋白解聚，同时亲环素促使L1蛋白与L2-DNA复合物分离。最后，L2-DNA复合体经高尔基体等细胞机器转运系统转移至细胞核膜上，同时由核受体介导进入细胞核，完成入胞过程。 HPV病毒侵入上皮细胞后，整个生活周期受到终末分化细胞特异的遗传因子调控。研究发现，病毒的生长周期与感染细胞的分化周期是一致的。随着基底层干细胞逐渐分化成为表皮细胞，病毒在此过程中依次进行早期蛋白的表达、DNA复制、晚期蛋白的表达及病毒颗粒的裝配以及病毒基因组的包裹。具体地，在病毒基因组进入到细胞核以后，宿主细胞的细胞因子结合到病毒基因LCR内的上游调控区（URR）启动早期基因的转录和表达。首先表达的是复制因子E1和E2，其次是E5、E6、E7等早期蛋白。E1和E2形成复合物结合到复制起始部位，同时吸引细胞聚合酶和辅助蛋白。E1、E2蛋白在细胞DNA复制分制的协助下启动病毒基因组的复制。随着上皮细胞进入终末分化期，病毒E6，E7基因的表达被上调，导致了大量的E6，E7蛋白表达。与此同时，晚期病毒基因表达被启动，表达L1和L2结构蛋白。L1和L2蛋白自发组装成能包裹病毒基因组的呈二十面体对称的球形衣壳，完成组装和病毒基因组包裹的成熟病毒颗粒从上皮的表层释放，同时分化细胞脱落。 病毒感染初期阶段，HPV是以游离状态存在的，随着感染细胞的的进一步病变恶化，在大部分癌症细胞中，HPV会整合到宿主基因组中。基因整合导致了E2开放阅读框的活性丧失，E2蛋白是一种特异性DNA结合蛋白，可调节病毒mRNA转录及DNA复制，而且E6、E7蛋白转化作用也受E2蛋白的调控，E2蛋白失活后丧失了抑制E6和E7蛋白转录的功能，从而导致E6和E7过度表达。功能研究表明，E6可与p53结合，E7与pRB结合，因此这两种蛋白的过度表达可导致这两种抑癌基因失活，使得细胞的增殖不受控制；E6还可以激活端粒酶，从而启动了细胞的转化，在细胞永生化和恶变过程中起重要作用。
 HPV基因组早期区包含约4.5kb碱基，主要编码病毒早期蛋白E1-E7，早期蛋白分别参与病毒的基因组复制、转录、翻译调控，对于病毒基因组在细胞内拷贝数维持和细胞转化具有十分重要的作用。 其中，E1蛋白基因是编码容量最大而且保守的基因，具有ATP酶和解螺旋酶活性，在发挥功能时能够结合到病毒DNA上，主要参与病毒基因组维持和复制。E1蛋白分子量约为68kDa，是由乳头瘤病毒编码的唯一具有酶活性的蛋白，它在发挥功能时是以六聚体形式存在。E1蛋白分子在体内发挥功能时是受到严格调控的，特别地，E1蛋白分子在细胞核内的累积是通过蛋白修饰的方式来调控的，从而达到控制整体分子数量的目的。 E2分子扮演着HPV病毒整个生活周期中至关重要的作用，不同种属的人头瘤病毒中的E2分子序列具有一定的差异，但所有E2分子都包含有两个主要功能域：转录激活域以及DNA结合域。目前，对于E2蛋白分子的结构与功能都有了比较深入的研究，转录激活区与DNA结合区域结构，E2蛋白主要参与了HPV病毒基因的转录调控，启动DNA复制以及病毒基因组的分割。同时，E2分子也被认为在病毒DNA的复制过程中、基因后转录以及病毒基因的包裹过程中扮演重要作用。另外研究认为，E2蛋白能够编码激活子和抑制子，调节HPV病毒早期基因的表达，与调控E6和E7转录的启动子之间相互作用，进而影响E6和E7的表达。特别地，在病毒生活周期中，E2分子会与E1分子相互作用，并且共同结合于复制起始部位的特定序列。 在早期蛋白基因转录mRNA片段中，有一类mRNA包括有E1的启示密码子以及临近的基因序列，该mRNA区域可翻译产生含有E4基因的基因产物E1~E4。不同的是，E4基因虽然位于乳头瘤病毒基因组的早期区域，但E4蛋白表达却发生在病毒繁殖的晚期，在晚期蛋白表达开始阶段。而作为判断的依据便在于E1~E4基因产物在病毒生活周期中，尤其是在病毒基因组扩增过程中能被检测到。在开放阅读框中，E4基因位于E2基因的编码框内，但拥有自己独立的读码框，其编码的Ｅ４蛋白能约束并打乱细胞质角蛋白网络，诱导上皮细胞骨架的解体，被认为可能在病毒成熟和促进病毒颗粒释放过程中起作用。 E5蛋白是一种膜蛋白，分子量较小，约由40~85个氨基酸组成，通常以二聚体形式存在，许多动物和人的乳头瘤病毒都能编码表达该蛋白，通常认为其扮演配体的角色，包括生长因子受体，主要通过丝裂素激活的蛋白激酶信号传递途径来传递生物信号，可能会刺激E6和E7蛋白的表达。目前研究较为深入的是BPV以及HPV16的E5蛋白，研究表明，E5蛋白虽然自身不具备蛋白酶活性，但是它可通过调节其他与细胞增生相关膜蛋白活性来发挥作用。 乳头瘤病毒感染上皮细胞引起皮肤黏膜良性或者恶心增生形成肿瘤，其中，发挥关键作用的是E6和E7基因，这两个基因对乳头瘤病毒的生长周期尤为重要，具有细胞转化活性，E6、E7蛋白可导致宿主细胞的永生化。其中，E6蛋白由150个氨基酸组成，分子量约为18kDa。该蛋白的空间结构主体为两个锌指结构，每个锌指结构的基础是Cys－X－X－Cys，为所有HPV型别E6蛋白所共有，这种结构作用于特异的氨基酸LXXLL模式区域，可以结合锌离子，在与细胞蛋白结合和细胞永生化等过程中具有十分重要的作用。E6蛋白转化细胞导致肿瘤形成的机制十分复杂，致使细胞永生化主要是通过多个细胞通路相互作用进而对细胞的生长特性进行调解。目前研究较为深入的一条途径是促进抑癌分子P53的降解。致癌型与非致癌型HPV的E6蛋白在功能上的不同主要体现在其与P53的结合活性上。另外，E6蛋白还可通过泛素介导的途径降解重要细胞调控因子Cmyc和Bak，能够抑制非P53依赖途径的细胞凋亡。此外，E6蛋白还可以激活端粒酶，并阻止类固醇受体辅助激活蛋白（SRC）家族激酶的降解，这在刺激增殖方面有重要作用。 E7蛋白由98个氨基酸组成，分子量约为11kDa，是HPV引导宿主细胞转化的重要功能蛋白。研究认为，E7蛋白的半衰期较短，可以很快降解为自由氨基酸残基。功能上，E7蛋白可以通过调节细胞生长因子及其调节因子的结合来实现对宿主细胞的调控。但值得注意的是，E7蛋白并不会在所有的乳头瘤病毒中均有编码表达，这可能跟特定HPV病毒的致病性有关。E7蛋白C末端含有一段与锌指结合的区域，该模式区域与E6蛋白中的类似。通过该区域，E7蛋白能够与pRB家族蛋白结合，破坏E2F和pRB复合体，然后释放出E2F细胞转录激活因子，致使初始细胞进行分裂，从而使细胞进入S期研究同时表明，E7蛋白可以激活钙离子依赖蛋白酶，直接降解pRB。另外，通过目前己有的研究发现，在高危型HPV中的E6和E7蛋白之间可以协同作用，导致细胞的癌转化，因此成为目前HPV治疗性疫苗研究的主要靶标。 HPV病毒是一种呈二十面体对称的球形颗粒，病毒衣壳蛋白主要由长约3000bp的晚期基因区（L区）表达的两个病毒衣壳蛋白组成：即主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。 其中，L1蛋白为HPV衣壳蛋白的主要组成成份，单体L1蛋白全长为504个氨基酸，分子量约为55~60kDa。L1蛋白可在体外多种不同的表达系统中高效表达，如昆虫细胞杆状病毒系统、大肠杆菌原核表达系统、酵母表达系统、和一些真核细胞，如293FT、TT细胞等可以在体外自组装成病毒样颗粒（virus－likeparticles，VLPs）。研究表明，二硫键的形成对于VLP组装至关重要，主要由相邻L1蛋白间Cys175和Cys428介导，Cys424也被证实扮演关键作用。研究表明，二硫键的正确形成与否跟病毒的成熟程度有关。L1蛋白集中了HPV天然病毒的绝大多数表位，通过免疫L1-VLP后可以获得高滴度的型特异性中和抗体，该中和抗体能够有效抵御天然HPV病毒的感染。研究者通过对不同型别的L1蛋白序列比对后发现，L1在型别间具有较高的同源性（70％以上），但不同型别HPV之间所产生的中和抗体交叉能力较弱，即每个基因型对应一个血清型。 结构研究表明，L1蛋白拥有一个由多个β-sheet组成的核心区域，该段核心区域在不同型别的HPV病毒L1蛋白序列之间是髙度保守的，而在该段同源区域之外，不同型别的L1蛋白之间主要存在5个高可变区，每个高可变区长度不一，包含大约10~30个氨基酸，在结构上，这些高变区均位于病毒颗粒表面暴露的环状区（LOOP区）上。根据生物化学数据和结构研究表明，目前已知的所有HPV中和单抗所识别的表位均位于这些表面暴露在颗粒表面的的高变环状结构上。科学家研究结果表明，构象型表位比线性表位更易于激发产生针对HPV的中和抗体。综合来讲，HPV的型特异性中和表位主要集中在L1蛋白上。由于L1VLP在结构上与天然病毒极为相似，且保留着大部分与天然病毒相同的中和表位，能够刺激机体产生高滴度的中和保护性抗体，因此HPV L1-VLPs成为世界范围内一种理想的疫苗形式。目前己上市的Mecrk公司的Gardasil®（HPV6/11/16/18四价疫苗），Gardasil9（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58九价疫苗）和GSK公司的GervarixTM（HPV16/18二价疫苗）均是L1-VLPs疫苗，这几种疫苗的临床结果验证了疫苗对于HPV感染的保护效果。 L2蛋白是HPV衣壳的另一种成分，它在病毒组装过程中与L1蛋白相互作用共同形成病毒的衣壳，同时在感染过程中扮演着重要作用。研究还表明，在病毒组装过程中L2蛋白还介导着HPV基因组的包裹，其N端区域为病毒DNA结合区域，可能在病毒颗粒形成过程中包裹病毒基因组中发挥重要作用。在VLP的组装中，L2蛋白主要起到的是辅助颗粒组装的作用，是否参与组装并不影响L1-VLPs的形成。同时研究还发现，L2蛋白在病毒吸附宿主细胞后经过一系列的构象变化和蛋白酶切，并以此完成病毒的感染宿主细胞过程，入胞后L2蛋白会携带病毒基因组转移至细胞核内，实现病毒基因组与宿主基因的整合。 在病毒颗粒中，L1蛋白和L2蛋白的摩尔量比例是5:1，其中L2蛋白在空间位置上位于五聚体中心的孔洞。研究发现HPV L2序列上相对保守，且免疫学上发现，在L2蛋白上存在着较多的HPV广谱中和表位，使用足够剂量的单一型别的HPVL2或融合L2表位的融合蛋白免疫小鼠后可产生能与多种型别HPV交叉反应的中和抗体，因此基于HPVL2的功能表位设计有望开发出预防HPV感染的广谱疫苗。 表2 HPV各蛋白的功能
目前针对HPV的预防性疫苗主要以具有天然空间结构的合成L1晚期蛋白病毒样颗粒作为靶抗原，诱发机体产生高滴度的血清中和性抗体，以中和病毒，并协助肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞清除病毒感染。主要作用机理HPV预防性疫苗通过向人体输送HPV病毒样颗粒蛋白诱发体液免疫，使人体产生抗体，在HPV病毒侵入时消灭病毒，预防HPV 感染。一项Lancet研究表明，接种HPV疫苗5-8年后，年轻女性高危型HPV患病率显著下降。
图5 HPV疫苗的作用原理 目前尚未有HPV治疗性疫苗的原因：HPV的DNA整合进细胞基因组之后，处于断裂位点的蛋白L2、E4、E5、E2通常会缺失，无法形成完整HPV病毒颗粒。但其中E6/E7两个蛋白仍然在诱导癌变，目前的HPV疫苗成分是针对L1蛋白产生抗体，无法阻止E6/E7蛋白功能。 当HPV的DNA整合进细胞基因组之前，HPV预防性疫苗也不能预防。HPV的蛋白不是一起表达的，而是先表达一系列E1~E7蛋白，然后再表达L1、L2蛋白。当细胞表达L1蛋白的时候，上皮基质细胞已经快到表层了。而以L1蛋白为主的HPV预防性疫苗，无法诱导免疫系统攻击已感染HPV但不表达L1的基质细胞。
目前已上市的HPV疫苗与临床进度靠前的HPV临床方案对比——CIN2/CIN3组织病变仍为大多数试验主要终点。 表3 目前主要HPV疫苗的研究情况
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