24 种中草药对致病性维氏气单胞菌体外抑菌活性研究

医学abeycd 2023-08-28 发布于湖北

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摘要: 近年来，我国养殖产业发展迅猛，病害问题也日益突出，严重制约了养殖行业的发展，造成了严重的经济损失。目前，细菌性疾病是危害鱼类养殖的最主要的生物源性疾病。为了探求和补充对维氏气单胞菌引起的水产动物病害防治有效的中草药种类，本试验以从罗氏沼虾体内分离得到并通过生化鉴定初步确定的维氏气单胞菌作为研究对象，选取24种中草药进行初筛，测定各中草药的抑菌圈直径，对中高度敏感且尚无关于维氏气单胞菌抑菌情况报道的几种中草药进行最小抑菌浓度(MIC)试验。结果表明:有7种中草药对维氏气单胞菌有抑菌效果，但抑菌活性差别较大。其中石榴皮对维氏气单胞菌的抑菌效果为高度敏感，地榆和诃子对维氏气单胞菌的抑菌效果为中度敏感，五倍子、乌梅、木瓜和白芍对维氏气单胞菌的抑菌效果为低度敏感。五倍子的 MIC 值最低，为7.125 mg/mL; 乌梅为15.625 mg/mL; 地榆、诃子均为62.5 mg/mL而木瓜的 MIC 值最高，为125 mg/mL。表明石榴皮、五倍子、乌梅、地榆、诃子、白芍这 6 种中草药对罗非鱼维氏气单胞菌的抑菌效果较好。

关键词: 中草药;抑菌效果;维氏气单胞菌; 罗氏沼虾;最小抑菌浓度(MIC)；最小杀菌浓度（MBC）

In vitro antibacterial activity of 24 Chinese herbal medicines against pathogenic Aeromonas veckert

Supervisor Xiao-Jun Zhang

ABSTRACT: In recent years, many countries’ aquaculture industry has developed rapidly, and at the same time, due to the expansion of farming scale and the increase in farming density, aquatic animal diseases caused by bacteria and virus frequently broke out, lead to huge economic losses in aquaculture. At present, the diseases caused by Aeromonas veronii have become the most general bacterial diseases that endanger fish farming. In order to explore and supplement the types of Chinese herbal medicines that are effective in the prevention and control of aquatic animal diseases caused by A. veronii, the bacteria JDM1-1 isolated from Macrobrachium rosenbergii was used in this experiment, which was determined as A. veronii in previous experiment. A preliminary screening of 24 Chinese herbal medicines was carried out to determine the diameter of the inhibition zone of each Chinese herbal medicine. The minimum inhibitory concentration (MIC) test was carried out on 7 kinds of Chinese herbal medicines which were highly sensitive and had no reports on the antibacterial situation of A. veronii. Among them, pomegranate peel is highly sensitive to the antibacterial effect of A. veronii, Sanyu and Myrobalan are moderately sensitive to the antibacterial effect of A. veronii, and Chinese gall, ebony, papaya and white peony are moderately sensitive to A. veronii. The MIC of Rhus chinensis Mill is the lowest, 7.125 mg/mL; The MIC of the Prunusmume is 15.625 mg/mL; The MIC of both Sanguilu and Myrobalan are 62.5 mg/mL, while the MIC of papaya is the highest, which is 125 mg/mL. The results of this study shows that the six Chinese herbal medicines of pomegranate peel, gallnut, ebony, sanyu, myrobalan, and white peony have better antibacterial effect on the A. veronii.

Key words: Chinese herbal medicine; antibacterial effect; Aeromonas veronii; Macrobrachium rosenbergii; minimum inhibitory concentration (MIC); minimum bactericidal concentration (MBC)

1. 前言

1.1. 维氏气单胞菌

1.1.1. 维氏气单胞菌生物学特征

维氏气单胞菌亦被称为维罗纳气单胞菌，隶属气单胞菌科（Aeromonadaceae）、气单胞菌属（Aeromonas）。维氏气单胞菌有杂交群分类属 DHG8/10，致病菌株多数属 DHG8[1]。该菌在普通营养琼脂上生长旺盛培养24ｈ后菌落直径多在1．3ｍｍ呈圆形、表面光滑、边缘整齐、灰白色、不透明、中央稍隆起，在血平板上生长良好可以形成明显的β－溶血。

1.1.2. 维氏气单胞菌毒力因子

维氏气单胞菌可产生一系列的毒力因子,引起败血症和胃肠炎等疾病与人类疾病的关系也较为密切。毒力因子如气溶素(aerolysin)、肠毒素(enterotoxin)和粘附因子，气溶素是主要的毒力因子，因为鱼类感染致病性维氏气单胞菌后常常有出血现象，其中肠毒素包括两大类：细胞兴奋性肠毒素和细胞毒性肠毒素，细胞兴奋性肠毒素刺激肠道加强分泌，细胞毒性肠毒素除有肠毒性外还有溶血性和细胞毒性，肠毒素与霍乱毒素（CT）可以引起交叉免疫反应经肠道免疫维氏气单胞菌的蝙蝠能较强的抵抗CT的侵害作用细菌感染的先决条件是在粘附因子的帮助下定植于患者机体患病部位[2]。

维氏气单胞菌的粘附因子包括菌毛、S层、荚膜、内毒素（LPS）和外膜蛋白（OMPS），菌毛分为两类：一是短的、坚硬的菌毛（S/R）二是长的、柔韧的菌毛（L/W）。量少的L/W菌毛更具粘附活性，是重要的凝血因子，LPS作为O抗原，把临床分离到的菌株主要分为两个血清型：O11和O34。O11血清型菌株可以产生S层，S层和荚膜能够帮助菌体逃避宿主的免疫调理作用，引起易感动物的败血症，荚膜还可以增强粘附素的粘附作用导致人类胃肠炎频发，部分温和生物型和全部维罗纳生物型菌株属O34血清型这类菌株在20℃时比在37℃时具有更强的致病性；OMPS是革兰氏阴性菌外膜中的蛋白成分其数量、种类随菌株不同而异，也可用于血清学分型困难时的细菌分型，维氏气单胞菌的OMPS主要有OMP38和OMP48两种是重要的毒力因子可以增强细菌的粘附作用，这些毒力因子在水产动物、人类与畜禽感染中起着举足轻重的作用，目前,对维氏气单胞菌毒力基因的研究不多,且常为温和型报道[3]。

1.1.3. 维氏气单胞菌对水生动物的危害

维氏气单胞菌包括2个生物型，即温和生物型和维罗纳生物型，前者的致病性和传染性较强，危害较大[4]，能感染鲤[5]、斑点叉尾鮰[6]、长吻鮠[7]等多种鱼类发病，临床症状表现为体表出血、腹水等，是一种具有感染性的条件致病菌，并会引起人腹泻、脑膜炎和败血症。在水体环境中维氏气单胞菌广泛存在，其繁殖速度在夏秋两季最快，在水质恶化、水产动物机体创伤或免疫力降低时可以引起很高的死亡率。近些年来，国内外关于维氏气单胞菌的研究呈逐步增多，而且有关其致病性的报道也逐年增多。

1.2. 中草药

1.2.1. 中草药概况

我国的中草药资源非常丰富，而且取材很也十分广泛，具有一定的抗药性，对于人体没有毒副作用，将水产品投放到市场中售卖，也并不需要担心人们的身体健康问题。重要的是，中草药对于水产养殖中产生的病害也有很好的防治作用。中草药中含有许多营养元素，比如蛋白质、氨基酸、维生素、常量元素以及多种微量元素等等。因此，开发毒副作用小、病原体不容易产生抗药性的中草药成为目前水产药物研究的热点之一。

1.2.2. 中草药在水产养殖中的研究现状

随着社会发展，人们对自身的健康越来越重视，对包括水产品在内的食品安全要求越来越高，2017年6月22日，农业部印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017～2020 年）》，明确兽用抗菌药物减量化推进、优化兽用抗菌药物品种[7]。有调查研究发现，细菌性疾病的预防和治疗最常用的方法就是名目繁多的抗生素，这会使病原菌激发极大的耐药性，抗生素残留更是有目共睹，水产品对人体的危害更是触目惊心，由于滥用抗生素不仅会对水产养殖环境有毒副作用，也会危害动物与人体健康[8]。抗生素的大量应用和滥用，导致使病原菌的耐药性增强，药物的效果也越来越不明显。而且鉴于我国水资源紧缺的现状，水产养殖业一定要与资源和环境相协调，否则将难以为继。要求大家在发展养殖业的时候，要与环境相协调，保护环境，造福子孙后代。有研究表示，中草药对人类和畜禽常见致病菌有较好的抑制作用，对不同的病原菌具有不同程度的抑菌作用[11]应用中草药诊治动物疾病，能够在改善免疫力、抵抗力的同时，达到治标又治本的效果，凭借这些优点的中草药被广泛应用于畜禽动物临床疾病治疗中，并取得了良好的效果[9]。

中草药作为中国传统医学中重要部分历史源远流长，在鱼类繁育及养殖中发挥着重要作用，具有药源广泛、成本低廉、易于提取、投喂方便、对养殖鱼类和养殖水体的毒副作用在有效安全范围内，不受肠道消化影响，同时能够有效避免水体相关环境影响，可增强机体免疫能力[13-14]。综合这些优点，中草药的发展趋势日益显著[15-16]，广泛并且深入地开展用于防治细菌性鱼病的中草药研究是非常有必要的。

1.2.3. 中草药免疫作用机理

在水产养殖和饲料中使用中草药可以控制原有微生物，提高水生动物的免疫功能，从而减少疾病的发生。在此期间，由于中药的成分过于复杂，中药的功能过于广泛，而且中药的许多成分会相互作用，这大大增加了专业研究人员对中药进行具体研究的难度

目前，中草药病理学的研究过程可分为三个基本层次:根据中草药的化学成分，通过各种提取分离方法，最终获得有效部位或单一组;根据中药的基本性质和临床使用的具体作用，进行最传统的药理分类;对水产养殖中发生的病害进行了全面的统计和总结，并采用分离培养的方法进行了单方提取中草药或复方提取抑菌试验。

比如很多中草药中都会含有比较丰富的糖类，在实际水产养殖病害防治中，研究较多的成分就是黄芪多糖、枸杞多糖与茯苓多糖等多种营养成分。经过科学实验研究，得出这几种糖类能够有效且快速地帮助水产生物形成抗体，其中NK细胞以及T·B淋巴细胞由抗体分泌在一定程度上增加，最终增强了水生生物对病害的抵抗能力。黄芪以及甘草等一些中草药中含有丰富的皂甙，相关研究人员对皂甙进行分析得出，皂甙能够有效增加CGMP/CAMP的比值，能够有效激活巨噬细胞，促进T·B细胞对于分裂原的基本反应，具有提升生物免疫力的重要作用，能够进一步提升网状内皮系统的吞噬性基本功能。黄连素可与DNA形成复合物，抑制DNA的合成;黄柏能影响细菌的呼吸，抑制ＲNA的合成;金银花可作用于细菌的细胞壁，抑制细胞壁的合成;黄芪、艾蒿可刺激细胞产生干扰素，直接抑制或破原菌的增殖能力[17]。

1.2.4. 中草药在水产养殖病害防治中的应用

目前，在水产养殖行业中，对于使用中草药的效果进行研究和分析，比较关注的方面是生物免疫力增强的方面。中草药能够提高水产养殖生物的免疫力，追溯本源就是因为中草药对提升生物机体的免疫器官具有大的明显的促进作用，进而可以有效提升生物的免疫力。所以针对水产养殖的生物，其目的主要是增强免疫力途径，通过加强生物的非特异性免疫反应来增强其机体的免疫力，具体通过使生物的皮肤和血清以及身体内的黏液中含有的溶酸酶活性得到进一步增强而实现。中草药很容易形成免疫的效果，最重要的是它含有多糖、有机酸有机酸和葡萄糖苷等成分，具有一定的挥发性作用，能有效提高水产养殖生物的免疫力。相关工作人员可以进行具体的实验研究，进一步总结SOD酶和血清溶菌酶的活性，对生物体的生长有很好的促进作用。刺激水产养殖生物进食的中草药中有一部分，具有相对特殊的香气，这样的气味可以刺激水产养殖生物的食欲。比如八角和鱼腥草等一些中草药可以起到很好的诱鱼作用。据相关研究，一些中草药含有相对丰富的芳香族小分子有机酸，包括含氮化合物、脂类、醛类、酞类等。大蒜的气味还能对鱼的嗅觉产生一定的影响，促进鱼的食欲，使鲢鱼和鳙鱼等鱼吃得更多。水产养殖中常用的给药方法为遍洒法，方法是：先将中草药捣碎，用水浸泡后，连渣带汁全池泼洒，干草药必须切碎后，煮一段时间再使用。可以有效防治病毒、原虫和致病性真菌感染。另外，还可以刺激水产养殖生物的进食。

鱼肉的不好会影响鱼产品的销售，将野鱼与人工饲养的鱼类相比，人工养的鱼类的鱼肉是明显不如野鱼类的。游离的氨基酸和不饱和脂肪酸影响等含量的浮动会对鱼类肉质产生影响。在病害防止与治疗的过程中，培育和繁殖工作人员可以通过使用中草药在此生物的体内行成一定的药物沉淀，让鱼产品的肉质提高;如果想让鱼产品蛋白质提高脂肪率下降的话，比如可以加入一些杜仲叶粉在饲料里，提高肉的改良。

含有比较丰富的生物碱和黄酮等成分的中草药可以，帮助水产养殖生物抵御细菌并治疗疾病，能够对病原微生物十分有效的杀菌或抑菌效果。黄芪多糖作为中成药投喂给草鱼、鲢鱼等，能够对鱼类肠道中的细菌结构进行一定改善，进而促进有益菌数量的增长，增强水产动物机体免疫力，提高水产动物抗应激能力，促进鱼类摄食、生长，减少病害发生，提高经济效益。

1.3. 研究目的与意义

由于多年来中草药具有副作用小、价格低廉、没有残留等特点，在水产养殖中的应用越来越广泛，并且在水产养殖中逐渐显露出良好的应用效果，因此寻找中草药代替抗生素，依靠中草药的抑菌治疗作用解决鱼类病害与预防问题成为了目前最可行的办法。本研究对从患病罗氏沼虾中分离的维氏气单胞菌进行体外抑菌试验，测定抑菌圈大小及最小抑菌浓度(MIC)，筛选出对维氏气单胞菌敏感的中草药，以期为维氏气单胞菌的中药防治提供依据。为了减少水产养殖业的压力，本研究共筛选24种中草药。本研究探讨这24种中草药对致病性维氏气单胞菌体外抑菌活性，通过比较 24 种效果，对鱼类的中草药研究提供了科学的依据。

2. 实验材料和方法

2.1. 实验材料

实验菌株为维氏气单胞菌，菌株JDM1-1从患病罗氏沼虾分离得到，保存于实验室-80℃冰箱。

试验用中草药购自同仁堂大药房，名录及其供试部位见表1。

2.2. 主要试剂和仪器

超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，电磁炉，普通固体培养基，普通液体培养基。

2.3. 中草药提取物的制备

分别取用上述 24 种中草药各50g加入 500 mL 无菌蒸馏水，液面浸过中草药浸泡30 min 后煮沸沸后用文火再煮1 h用4层纱布过滤药液收集滤液。药渣加水 50 0mL 煮沸后煎 30 min 过滤药液；合并两次药液，文火浓缩至50 mL (此时中草药原药浓度为 1 g/mL)，即为100%中草药原液[18]。

2.4. 菌悬液的制备

取-80℃保存菌株JDM1-1，接种于LB固体培养基上，28 ℃培养24 h，以铂丝环蘸取菌苔在琼脂平板上三区划线，培养16 h后挑取单个菌落接种于普通肉汤培养基中培养16~18 h。培养后使用分光光度计测定其OD600以确定菌液浓度，之后用普通肉汤培养基稀释终浓度为107CFU/ml的应用菌液[19]。

2.5. 抑菌圈的测定

采用平板挖洞法进行中药有效成分的体外抑菌试验。在超净工作台中，用直径9 cm 培养皿，待培养基冷却后在培养皿底部划十字线，将培养皿等分为四个区域，用无菌的滴管加入0.1 mL的菌液到平板内，浓度107CFU/ml，用无菌涂布棒涂满平板表面，盖好培养皿，在超净工作台中室温下放置一会，待平板表面稍干用直径为6 mm打孔器打4个大小一致的孔洞并在底部的相应位置作好记号。在孔洞里分别加入30 ul中药有效成分药液，将平板放入4 ℃冰箱中让药液扩散30 min后小心地平移到恒温培养箱中28 ℃培养24 h，每种中药有效成分做3次重复，观察其结果并测量各孔周围抑菌圈直径。

结果判定:观察空洞周围有无抑菌圈，用游标卡尺量取其直径(包括空洞直径)大小，每孔取不同方向测量两次，采用单因素方差分析24种中药有效成分对3株细菌的体外抑菌圈直径，最终求取三孔共六次测量结果的平均值，以毫米为单位记录，结果以X+SD表示。按抑菌环直径的大小报告极敏、高敏、中敏、低敏[20-21]。

2.6. 最小抑菌浓度（MIC）的测定

根据平板打孔法的结果，选取抑菌圈直径15.00 mm左右的中药有效成分，采用二倍稀释法，分别测定中药有效成分对菌株JDM1-1的最小抑菌浓度。

取无菌肉汤培养基试管10支，于1~9管中各加入无菌肉汤培养基2 ml，然后于第1管中加入中药有效成分液2ml，混匀后取出2ml加人第2管，依此类推，直到第8管中取出2ml弃去，第9管为普通肉汤培养基对照，第10管为中药原液对照。然后1~9管加入供试菌液0.1 ml，摇匀，每种中药有效成分做3次重复，置37 ℃恒温箱中培养18 h。在空白对照下，以眼睛观察各个试管中以不发生浑浊变化的最高药物稀释倍数作为该药物的最小抑菌浓度(Minimal Inhibition Concentration，简称MIC) [22]。

2.7. 最小杀菌浓度（MBC）的测定

在MIC试验基础上将在清晰无菌生长的试管用涂布棒蘸取营养液分别涂布到相应的琼脂平板培养基，在28 ℃的恒温培养箱培养过夜 (24-48 h)，以琼脂平板上菌落数不超5个的最低药物浓度作为该药物对该菌株的最小杀菌浓度 (Minimal Bacteriacidal Concentration，简称MBC)。根据MIC值和MBC值评价中药有效成分的体外抗菌活性[23]。

3. 结果

3.1. 抑菌圈测定结果

24种中草药对病原菌体外抑菌结果见表2。

注：直径≥20 mm判为高度敏感, 表示为“+++”；直径在15~20 mm间判为中度敏感，表示为“++”；直径 10~15 mm判为低度敏感，表示为“+”；直径≤10 mm判为不敏感，表示为“-”

3.2. 最小抑菌浓度（MIC）测定结果与最小杀菌浓度（MBC）测定结果

经过体外抑菌实验共筛选出7种中草药具有较好的抑菌效果。这7种中草药对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）测定结果与最小杀菌浓度（MBC）测定结果见表3。

表3 7种中草药对致病菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

4. 讨论

近几年来已经有不少关于中草药抑菌杀菌的研究报道，如马志宏等用33种药物对致病性维氏气单胞菌进行体外抑菌试验发现，马齿苋对维氏气单胞菌有抑菌效果，张召兴等的研究结果发现五味子对维氏气单胞菌的抑菌效果最明显[24-25]。朱成科的150种中草药体外抑杀维氏气单胞菌的研究中五倍子石榴皮、地榆和乌梅有不错的抑菌效果与本研究结果的一致[26]。龙继兵等 80 种中草药水提物中体外抑菌试验发现大黄对维氏气单胞菌有抑菌效果，与本试验结果不一致[27]。其可能与感染动物和维氏气单胞菌致病性的不同以及通过传代培养产生的变异有关。除此以外，由于不同产地的中草药有效成分不同，以及中草药加工、提取的方法不同，其对细菌的敏感性也存在一定的区别，这些都可能会造成结果存在差异。

本实验结果表明，在试验条件相同的情况下，石榴皮、五倍子、乌梅、地榆、白芍、木瓜因抑菌圈直径均大于10 mm，表现为抑菌作用强。本试验抑菌圈直径在 10 mm 以上，MIC 介于 15.63~31.25 mg/mL 之间有五倍子、乌梅抑菌杀菌效果最好。五倍子抑菌效果最好，，抑菌圈直径达 11.58mm，最小抑菌浓度为 7.125 mg/mL，最小杀菌浓度为 31.25 mm。其次为乌梅抑菌圈直径高 13.5 mm，最小抑菌浓度为 15.625 mg/mL，最小杀菌浓度为 31.25 mm。表明了乌梅等6种中草药对预防和治疗由维氏气单胞菌引起水产动物疾病具有良好的应用前景。

致谢

感谢导师

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